任革，羅璐，賈永軍，李晨，魏鵬飛，史琳娜

（1陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712000）

肺癌在我國(guó)是常見(jiàn)的腫瘤之一。肺癌每年造成的死亡人數(shù)大約在160萬(wàn)，其中85%的死亡患者的病理類型是非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）［1］。目前NSCLC的治療已從經(jīng)驗(yàn)主導(dǎo)的細(xì)胞毒治療，逐漸發(fā)展為具有更好治療效果的分子靶向治療［2］。隨著靶向治療和免疫治療的發(fā)展以及聯(lián)合治療方案的優(yōu)化已大幅提高了NSCLC患者的生存期，但是依然無(wú)法真正達(dá)到滿意的治療效果［3］。因此繼續(xù)發(fā)掘和開(kāi)發(fā)新的藥物和治療方案意義重大，但這需要基礎(chǔ)研究為其提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

目前研究顯示重樓皂苷VII（Paris saponin VII，PP7）對(duì)多個(gè)腫瘤具有抑制作用［4］，包括肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌等，靶向磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoInositide-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mammalian target of rapamycin，mTOR）等多個(gè)分子通路，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和周期阻滯，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，逆轉(zhuǎn)耐藥性等［5-6］。這盡管可以提示PP7在基礎(chǔ)研究中表現(xiàn)出了較好的抗腫瘤效果，但是隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制有了更深入的認(rèn)識(shí)。因此，在新的角度進(jìn)一步闡明PP7的抗腫瘤作用和機(jī)制，將為其進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供更加堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。近幾年研究顯示微小RNA（microRNA，miRNA）在長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和信使RNA（messenger RNA，mRNA）之間具有內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）作用，細(xì)胞可通過(guò)調(diào)控ceRNA作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA的調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞生物學(xué)特征［7］。lncRNA可競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合miRNA，減少或者降解細(xì)胞中游離的miRNA，進(jìn)而解除miRNA對(duì)靶點(diǎn)mRNA的結(jié)合和降解作用［8］。這種作用已經(jīng)在多個(gè)腫瘤中被觀察到，其可對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮作用，并影響腫瘤細(xì)胞多個(gè)特征的獲得［9-11］。本研究將通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)并篩選NSCLC中可能存在的ceRNA作用，并探索PP7是否通過(guò)影響所預(yù)測(cè)的ceRNA作用產(chǎn)生抗腫瘤作用，為PP7的抗腫瘤作用提供參考資料。

材料和方法

1 細(xì)胞

NSCLC細(xì) 胞 系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299和NCI-H358細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。BEAS-2B細(xì)胞購(gòu)自長(zhǎng)沙艾碧維生物科技有限公司。

2 主要試劑

PP7（S31366，上海源葉生物科技有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；04-001-1ACS，Biological Industries）；RPMI1640培養(yǎng)液（MA0551，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；0.25%胰蛋白酶（MA0234，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；MTT（S19063，上海源葉生物科技有限公司）；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒（P0010S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PI/AnnexinⅤ凋亡檢測(cè)試劑盒（40302ES60，上海翊圣生物股份有限公司）；caspase-3/7活性檢測(cè)試劑盒（E607103，上海生工生物工程有限公司）；兔抗叉頭框蛋白P1（forkhead box protein P1，F(xiàn)OXP1）抗體（ab227649，Abcam）；RIPA裂解液（P0013K，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光液（P0018S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-山羊抗兔Ⅱ抗（bs-0295G-HRP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；RNAiso Plus（9108，TaKaRa）；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A，TaKaRa）；Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green?Kit（638316，TaKaRa）；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（R202，上海新貝生物科技有限公司）；miRNA-19a-3p inhibitor購(gòu)自上海吉瑪生物科技有限公司。

3 方法

3.1 細(xì) 胞培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299和NCI-H358細(xì)胞均使用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度后，以1∶3傳代細(xì)胞。

3.2 短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）沉默慢病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染針對(duì)lncRNA AL158206.1 RNA序列設(shè)計(jì)短發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)（TTTATGGCATCGCTCATATATCTCGAGAAATACCGTAGCGAGTATATA），將該結(jié)構(gòu)克隆到慢病毒載體中，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒包裝，提取純化慢病毒載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，簡(jiǎn)要步驟如下：在6孔板中待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%匯合度后，用含有5 mg/L聚凝胺的2 mL新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液。37℃孵育。4 h后加入2 mL新鮮培養(yǎng)基以稀釋聚凝胺。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）熒光，挑選綠色熒光強(qiáng)而細(xì)胞毒性低的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度后，嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 MTT實(shí)驗(yàn)待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度后，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞至單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液以每孔1×104種植于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，以0、0.5、1、2、4、8、16和32μmol/L濃度梯度的PP7干預(yù)細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加入150μL的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），避光搖晃15 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（A）。

3.4 實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)選取2、4、8μmol/L濃度的PP7干預(yù)HCC827細(xì)胞24 h（n=3）；同時(shí)將shRNA沉默技術(shù)構(gòu)建的lncRNA AL158206.1 RNA沉默慢病毒載體和合成的miRNA-19a-3p抑制劑（miRNA inhibitors），轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分組干預(yù)，分組如下：空白組（無(wú)任何處理的正常培養(yǎng)細(xì)胞）、shRNA lncRNA組（轉(zhuǎn)染shRNA慢病毒載體沉默lncRNA AL158206.1）、miRNA inhibitors組（轉(zhuǎn)染miRNA inhibitors下調(diào)miRNA-19a-3p）、PP7組（4μmol/L PP7干預(yù)細(xì)胞24 h）、PP7+shRNA lncRNA組（在沉默lncRNA AL158206.1基礎(chǔ)上用4μmol/L PP7干預(yù)細(xì)胞24 h）、PP7+shRNA lncRNA+miRNA inhibitors組（在沉默lncRNA AL158206.1和用4μmol/L PP7干預(yù)細(xì)胞24 h的基礎(chǔ)上再用miRNA inhibitors轉(zhuǎn)染細(xì)胞），各組n=3。

3.5 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡將細(xì)胞收集于離心管中，PBS離心洗滌后，用100μL Binding buffer重懸約5×105個(gè)細(xì)胞。加入10μL PI染液和5μL AnnexinⅤ-FITC染液，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

3.6 caspase-3/7活性檢測(cè)按照caspase-3/Caspase 7活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，并在熒光顯微鏡下觀察熒光變化。

3.7 qPCR實(shí)驗(yàn)按照RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞的總RNA（酚-氯仿法），F(xiàn)OXP1和lncRNA AL158206.1 RNA按照PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）說(shuō)明書(shū)合成cDNA，miRNA的逆轉(zhuǎn)錄按照加A尾反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，隨后將FOXP1和lncRNA AL158206.1 cDNA按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量，其反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃30 s；變性95℃10 s→退火延伸60℃10 s，40個(gè)循環(huán)。miRNA的cDNA按照Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green?Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量。利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物信息見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for qPCR

3.8 Western blot實(shí)驗(yàn)RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，調(diào)整各組蛋白濃度一致，進(jìn)行SDS-PAGE。依次經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，4℃孵育Ⅰ抗（1∶2 000稀釋）過(guò)夜，洗滌后，室溫孵育HRP標(biāo)記的Ⅱ抗2 h，洗滌后，加入ECL發(fā)光液，曝光顯影，對(duì)顯影的條帶用Image Pro Plus軟件測(cè)量光密度，進(jìn)行半定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 21.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差具有齊性，組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗(yàn)，若方差不齊，組間兩兩比較采用Dunnett T3檢驗(yàn)。計(jì)量資料若不符合正態(tài)分布，以四分位表示，組間兩兩比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TargetScan在線預(yù)測(cè)

TargetScan軟件預(yù)測(cè)顯示miRNA-19a-3p與FOXP1 mRNA 3，UTR具有高度保守的特異性結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合方式為8mer，結(jié)合位點(diǎn)詳細(xì)信息見(jiàn)圖1。

2 Starbase在線預(yù)測(cè)

通 過(guò)Starbase預(yù) 測(cè) 軟 件（http：//starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php？source）觀 察 到miRNA-19a-3p與lncRNA AL158206.1具有特異性結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合方式為7mer-m8（圖2A）。進(jìn)一步分析顯示在肺腺癌、肝癌、侵襲性乳腺癌、肉瘤、直腸腺癌、結(jié)腸腺癌中miRNA-19a-3p與lncRNA AL158206.1具有顯著負(fù)相關(guān)性（圖2B～F），與lncRNA AL158206.1表達(dá)量相比，miRNA-19a-3p表達(dá)量均顯著升高（圖2G～K）。

3 FOXP1、lncRNA AL158206.1和miRNA-19a-3p在NSCLC中的表達(dá)

與正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B相比，A549、HCC827、NCI-H1299和NCI-H358細(xì) 胞 中miRNA-19a-3p的表達(dá)均顯著升高（P＜0.01），F(xiàn)OXP1和lncRNA AL158206.1表達(dá)均顯著下降（P＜0.01），其中HCC827細(xì)胞中FOXP1、lncRNA AL158206.1和miRNA-19a-3p的表達(dá)變化最顯著（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

4 PP7對(duì)HCC827細(xì)胞活力的影響

在相同干預(yù)時(shí)間下，隨著PP7干預(yù)濃度的升高，對(duì)HCC827細(xì)胞活力的抑制率逐漸升高；在相同干預(yù)濃度下，隨著PP7干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)HCC827細(xì)胞活力的抑制率逐漸升高。因此，PP7對(duì)HCC827細(xì)胞活力抑制具有濃度-時(shí)間依賴性。在干預(yù)24、48和72 h下，PP7對(duì)HCC827細(xì)胞活力抑制的IC50分別為2.75、1.56和0.64μmol/L。見(jiàn)圖4。

Figure 1.TargetScan software predicted the binding of miRNA-19a-3p to 3"UTR of FOXP1 mRNA，which showed that miRNA-19a-3p had highly conserved specific binding sites with FOXP1 mRNA 3"UTR.圖1 TargetScan軟件預(yù)測(cè)miRNA-19a-3p與FOXP1 mRNA 3"UTR的結(jié)合

Figure 2.Starbase software predicted the specific binding sites of miRNA-19a-3p and lncRNA AL158206.1，and the expression relationship between them in different cancers，which showed that miRNA-19a-3p had a specific binding site with lncRNA AL158206.1（A），and miRNA-19a-3p was significantly negatively correlated with lncRNA AL158206.1 in multiple tumors（B～K）.圖2 Starbase軟件預(yù)測(cè)miRNA-19a-3p與lncRNA AL158206.1特異性結(jié)合位點(diǎn)，以及二者在不同腫瘤中的表達(dá)關(guān)系

5 PP7對(duì)HCC827細(xì)胞凋亡的影響

與空白組相比，PP7可濃度依賴地誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞凋亡，其中與空白組相比，2、4、8μmol/L的干預(yù)組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.01）。在分子水平上，PP7可濃度依賴地促進(jìn)細(xì)胞中caspase-3/7蛋白活性及含量（P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

6 PP7對(duì)HCC827細(xì) 胞 中FOXP1、lncRNAAL158206.1和miRNA-19a-3p表達(dá)的影響

與空白組相比，PP7可濃度依賴地提高HCC827細(xì)胞中FOXP1 RNA、lncRNA AL158206.1表達(dá)量，而抑制miRNA-19a-3p的表達(dá)，其中4、8μmol/L濃度的干預(yù)組FOXP1、lncRNA AL158206.1表達(dá)顯著升高，miRNA-19a-3p表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

7 PP7通過(guò)提高lncRNA AL158206.1，通過(guò)ceRNA作用，降低miRNA-19a-3p含量，抑制NSCLC

與空白組相比，shRNA lncRNA組細(xì)胞凋亡和caspase-3/7活性未發(fā)生變化，miRNA inhibitors組和PP7組肺癌細(xì)胞凋亡和caspase-3/7活性顯著升高（P＜0.01）。與PP7組比，PP7+shRNA lncRNA組細(xì)胞凋亡和caspase-3/7活性顯著下降（P＜0.01）。與PP7+shRNA lncRNA組 相 比，PP7+shRNA lncRNA+miRNA inhibitors組細(xì)胞凋亡和caspase-3/7活性顯著上升（P＜0.01）。見(jiàn)圖7。

Figure 3.The expression of FOXP1，lncRNA AL158206.1 and miRNA-19a-3p in non-small cell lung cancer.The expression of FOXP1 protein was detected by Western blot（A）and semi-quantitative analysis（B）；qPCR detected the expression of FOXP1，lncRNA AL158206.1 and miRNA-19a-3p（C～E）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs BEAS-2B group；##P＜0.01 vs HCC827 group.圖3 FOXP1、lncRNA AL158206.1和miRNA-19a-3p在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

Figure 4.Effect of PPT on the viability of HCC827 cells.PP7 inhibited the viability of HCC827 cells in a concentration-and time-dependent manner.Mean±SD.n=6.圖4 PP7對(duì)HCC827細(xì)胞活力的影響

與空白組相比，shRNA lncRNA組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AL158206.1表達(dá)顯著降低，miRNA-19a-3p顯著升高，F(xiàn)OXP1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，miRNA inhibitors組和PP7組肺癌細(xì)胞lncRNA AL158206.1顯著升高（P＜0.05），miRNA-19a-3p顯著降低，F(xiàn)OXP1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。與PP7組 比，PP7+shRNA lncRNA組 細(xì) 胞lncRNA AL158206.1顯著降低（P＜0.01），miRNA-19a-3p顯著升高，F(xiàn)OXP1 mRNA和蛋白質(zhì)均顯著降低（P＜0.01）。與PP7+shRNA lncRNA組相比，PP7+shRNA lncRNA+miRNA inhibitors組 細(xì) 胞lncRNA無(wú)顯 著 變 化（P＞0.05），miRNA-19a-3p顯 著 降 低，F(xiàn)OXP1 mRNA和 蛋 白 均 顯 著 升 高（P＜0.01）。見(jiàn)圖8。

討 論

FOXP1基因作為轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤中的作用具有雙重性，在胃癌、肝癌和黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤等腫瘤中表現(xiàn)為促癌作用［12-13］，在乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌、卵巢癌、前列腺癌及腎癌等腫瘤中起抑癌作用［14-16］。這種雙重作用與腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的FOXP1相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)密切聯(lián)系，明確FOXP1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)于篩選挖掘治療藥物具有重要意義。本研究通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件檢測(cè)到miRNA-19a-3p對(duì)FOXP1的表達(dá)可能具有一定的靶向抑制調(diào)控作用，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后和治療方案的選擇等。同時(shí)進(jìn)一步預(yù)測(cè)顯示miRNA-19a-3p與lncRNA AL158206.1具有特異性結(jié)合位點(diǎn)。目前研究顯示lncRNA具有“海綿”作用，可與miRNA結(jié)合，對(duì)miRNA起到吸附作用，影響細(xì)胞中游離miRNA的量，進(jìn)而調(diào)控miRNA對(duì)mRNA的抑制作用，同時(shí)lncRNA可與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，直接調(diào)控miRNA與mRNA的結(jié)合，影響mRNA的表達(dá)［17-18］。因此本研究推測(cè)miRNA-19a-3p與lncRNA AL158206.1之間存在ceRNA作用。生信分析進(jìn)一步檢測(cè)在多個(gè)腫瘤中miRNA-19a-3p與lncRNA AL158206.1具有顯著負(fù)相關(guān)性，與lncRNA AL158206.1表達(dá)量相比，miRNA-19a-3p表達(dá)量均顯著升高?；谏鲜鲱A(yù)測(cè)，本研究推測(cè)在NSCLC中FOXP1具有抑癌作用。這種抑癌作用被miRNA-19a-3p的高表達(dá)所中和，而lncRNA AL158206.1表達(dá)量下調(diào)，又是導(dǎo)致miRNA-19a-3p高表達(dá)的原因。因此，如果上調(diào)lncRNA AL158206.1表達(dá)，可能會(huì)通過(guò)下調(diào)miRNA-19a-3p與FOXP1 mRNA的相互作用量，上調(diào)FOXP1的表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到抑癌的作用。

Figure 5.Effect of PP7 on apoptosis of HCC827 cells.A：after PP7 with the gradient concentration intervened the cells for 24 h，the cell apoptosis was detected by flow cytometry，and the apoptosis rate was statistically analyzed；B：caspase-3/7 kit was used to detect the caspase-3/7 activity（scale bar=50μm），and the optical density as analyzed by Image-Pro Plus software for statistics.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖5 PP7對(duì)HCC827細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6.Effect of PP7 on the expression of FOXP1，lncRNA AL158206.1 and miRNA-19a-3p in HCC827 cells.After the gradient concentration of PP7 intervened the cells for 24 h，the expression of FOXP1 protein in the cells was detected by Western blot（A）and semi-quantitative analysis（B）；qPCR was used to detect the RNA expression of FOXP1，lncRNA AL158206.1 and miRNA-19a-3p（C～E）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖6 PP7對(duì)HCC827細(xì)胞中FOXP1、lncRNA AL158206.1和miRNA-19a-3p表達(dá)的影響

Figure 7.Changes of HCC827 cell apoptosis in each group.A：after PP7，miRNA inhibitor and shRNA lncRNA intervened cells alone or in combination for 24 h，the cell apoptosis was detected by flow cytometry，and the apoptosis rate was statistically analyzed；B：caspase-3/7 kit was used to detect the caspase-3/7 activity（scale bar=50μm），and the optical density was analyzed by Image-Pro Plus software for statistics.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group；##P＜0.01 vs PP7 group；△△P＜0.01 vs PP7+shRNA lncRNA group.圖7 各組HCC827細(xì)胞凋亡的變化

基于上述推測(cè)，本研究將在體外選擇相關(guān)NSCLC細(xì)胞系作為研究對(duì)象，探索PP7的抗腫瘤作用。盡管體外培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所處微環(huán)境方面具有顯著差異，但是由于體外培養(yǎng)細(xì)胞環(huán)境的可控性和單一性，結(jié)果可重復(fù)性良好，并同時(shí)保留了腫瘤細(xì)胞的主要特征和遺傳背景，使其在最初的基礎(chǔ)研究中被廣泛應(yīng)用，并使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可靠性。

本研究顯示PP7可時(shí)間-濃度依賴地抑制HCC827細(xì)胞活力，誘導(dǎo)其凋亡。目前已有研究顯示PP7可誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞自噬和凋亡，而這與PP7可直接激活A(yù)MPK密切相關(guān)［19-20］，但是PP7抑制NSCLC細(xì)胞更進(jìn)一步的分子機(jī)制尚未研究。本研究結(jié)合預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)PP7可通過(guò)lncRNA AL158206.1與miRNA-19a-3p的ceRNA作 用 提 高FOXP1的表達(dá)，抑制HCC827細(xì)胞。

為證實(shí)上述推測(cè)，本研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默lncRNA AL158206.1后PP7誘 導(dǎo)HCC827細(xì)胞凋亡的能力被顯著減弱，同樣由PP7誘導(dǎo)增強(qiáng)的caspase-3/7活性在沉默lncRNA AL158206.1后顯著下降，提示lncRNA AL158206.1介導(dǎo)PP7誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞凋亡。但是降低miRNA-19a-3p表達(dá)可誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，使lncRNA AL158206.1沉默所導(dǎo)致的減弱的PP7誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞凋亡能力得以恢復(fù)，同時(shí)逆轉(zhuǎn)lncRNA AL158206.1沉默所導(dǎo)致的降低的PP7提高HCC827細(xì)胞中caspase-3/7活性的能力。caspase-3/7的活性直接影響細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者［21-22］。因此，根據(jù)上述結(jié)果推測(cè)PP7可通過(guò)提高lncRNA AL158206.1，降低miRNA-19a-3p含量，誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞凋亡。

Figure 8.Changes of FOXP1，lncRNA AL158206.1 and miRNA-19a-3p in HCC827 cells of each group.After PP7，miRNA inhibitor and shRNA lncRNA intervened cells alone or in combination for 24 h，the expression of FOXP1 protein in the cells was detected by Western blot（A）and semi-quantitative analysis（B）；qPCR was used to detect the RNA expression of FOXP1，lncRNA AL158206.1 and miRNA-19a-3p（C～E）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs blank group；##P＜0.01 vs PP7 group；△△P＜0.01 vs PP7+shRNA lncRNA group.圖8 各組HCC827細(xì)胞FOXP1、lncRNA AL158206.1和miRNA-19a-3p的變化

本研究進(jìn)一步對(duì)各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AL158206.1、miRNA-19a-3p以及FOXP1的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果，顯示在HCC827細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AL158206.1與miRNA-19a-3p之間存在ceRNA作用，并可能調(diào)控FOXP1的表達(dá)?；谠揷eRNA作用，重樓皂苷可提高HCC827細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AL158206.1表 達(dá)，降 低miRNA-19a-3p表 達(dá)，增 強(qiáng)FOXP1 mRNA和蛋白的表達(dá)。但是lncRNA AL158206.1沉默后PP7無(wú)法有效降低HCC827細(xì)胞中miRNA-19a-3p表達(dá)以及提高FOXP1 mRNA和蛋白的表達(dá)，但是繼續(xù)抑制已經(jīng)沉默了lncRNA AL158206.1的HCC827細(xì)胞中miRNA-19a-3p的表達(dá)，再經(jīng)PP7干預(yù)可顯著提高細(xì)胞中FOXP1 mRNA和蛋白均顯著升高。

綜合上述，本研究初步證實(shí)在HCC827細(xì)胞中FOXP1作為抑癌因子，受到lncRNA AL158206.1與miRNA-19a-3p之間存在的ceRNA作用的調(diào)控，使其維持在較低水平，進(jìn)而促進(jìn)HCC827細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡。PP7可通過(guò)提高lncRNA AL158206.1的表達(dá)，降低HCC827細(xì)胞中miRNA-19a-3p的含量，解除或降低miRNA-19a-3p對(duì)FOXP1表達(dá)抑制作用，從而提高FOXP1的表達(dá)，達(dá)到抑制NSCLC的作用。本研究不僅為抑制NSCLC提供了潛在的作用靶點(diǎn)，同時(shí)闡明了PP7抑制NSCLC的分子機(jī)制，為其應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。