高曉陽，金蓉，顏羽昕，張春艷，趙曉璐，馬月宏

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是以細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度積聚為特征的慢性肝損傷的病理生理結(jié)果［1-2］，它是一個動態(tài)過程，涉及實質(zhì)細胞（肝細胞）、肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）、肝竇內(nèi)皮細胞以及駐留和浸潤的免疫細胞間的相互作用［3］。其中，HSCs是受損肝臟中產(chǎn)生ECM的主要細胞，HSCs的增殖活化是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的核心事件。持續(xù)性的肝損傷會不斷激活HSCs，最終導(dǎo)致纖維疤痕形成，并進一步發(fā)展為肝硬化、肝癌和肝衰竭等［4］。蒙藥七味清肝散是被明確記載在《內(nèi)蒙古蒙成藥標準》中的經(jīng)典藥方，別名“額力根-7味”散，由藍盆花、紅花、香青蘭、瞿麥、石膏、五靈脂和人工牛黃等7味藥組成，具有清肝熱的功效，臨床上已用于肝熱、目赤黃疸、肝區(qū)疼痛、發(fā)熱口渴和頭痛等癥狀的治療［5-6］，不足的是，該方的具體適應(yīng)癥及其藥理作用機制仍尚不明確?；谡n題組前期對七味清肝散的研究，通過轉(zhuǎn)錄組測序，并運用網(wǎng)絡(luò)藥理學分析可知，七味清肝散的藥理作用可能通過影響微小RNA（microRNA，miR）和/或磷酸酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）/磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信號通路發(fā)揮作用［7-8］。研究表明，由四氯化碳（CCl4）、膽管結(jié)扎（bile duct ligation，BDL）或硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）誘導(dǎo)的HF動物模型中，miR-21在血清和肝臟中的表達均明顯上調(diào)［9-10］。在機制上，miR-21的過表達激活HSCs，促進氧化，增加膠原合成，并通過Smad7/Smad2/3/NADPH氧化酶4、程序性細胞死亡4（programmed cell death 4，PDC4）/AP-1和PI3K/Akt等途徑激活血管緊張素，增加纖維化風險；當miR-21基因被敲除后，脂肪變性、炎癥和脂肪細胞凋亡均將減少，有利于抗纖維化［11］。因此，本項工作通過構(gòu)建HF大鼠模型和設(shè)計細胞實驗，探討七味清肝散對miR-21和PTEN/PI3K/Akt信號通路表達水平的影響，以期為HF治療提供參考資料。

材料和方法

1 實驗動物及細胞系

清潔 級6～8周齡雄性Wistar大鼠50只，體重（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0006］。所有大鼠均飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學動物實驗中心，溫度（20±2）℃，自由進食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行后續(xù)實驗。

大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購于北京北納科技有限公司。

2 藥品與主要試劑

藍盆花、紅花、香青蘭、瞿麥、石膏、五靈脂和人工牛黃7味藥材購自內(nèi)蒙古天盛蒙中醫(yī)有限責任公司，已由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學蒙醫(yī)藥學院蒙藥炮制實驗中心鑒定為真品。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和羥脯氨酶（hydroxyproline，HYP）試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司產(chǎn)品；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色液、Masson染色試劑盒、MTT試劑盒及Triquick Reagent購自北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；miRNA模擬物和抑制劑和轉(zhuǎn)染試劑購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑購自北京天根生化科技有限公司；免抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、免抗Ⅰ型膠原蛋白（collagen type I，Col I）、免抗PTEN、免抗PI3K、免抗Akt及免抗GAPDH抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

3 主要方法

3.1 動物分組、建模及處置取30只Wistar大鼠隨機分為對照（control）組、模型（model）組、低劑量（135 mg·kg-1·d-1）七味清肝散（low dose）組、中劑量（270 mg·kg-1·d-1）七清肝散（medium dose）組和高劑量（405 mg·kg-1·d-1）七味清肝散（high dose）組，每組6只。參照文獻［7，12］，所有大鼠均以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，除對照組外，其余大鼠按2 mL/kg的劑量以50% CCl4-橄欖油溶液灌胃，每周2次，同時低、中、高劑量組以相應(yīng)劑量藥物灌胃，每天1次，持續(xù)8周。最后一次灌胃12 h前禁食不禁水，灌胃后1～2 h內(nèi)用10%水合氯醛溶液（3 mL/kg）麻醉，腹主動脈采血，靜置20 min，1 006.2×g離心15 min，得到血清，并取肝組織進行后續(xù)實驗。

3.2 七味清肝散含藥血清的制備七味清肝散處方中除人工牛黃的各味藥材（藍盆花60 g、紅花180 g、香青蘭60 g、瞿麥60 g、石膏180 g、五靈脂60 g）粉碎過100目篩，得到的粉末再與人工牛黃80 g混合，以0.5%羧甲基纖維素鈉溶解。將20只Wistar大鼠隨機分為2組，即對照組（等量氯化鈉溶液）和給藥組（1.35 g/kg七味清肝散溶液）［7］，每天灌胃1次。第8天給 藥1～2 h后 腹主動 脈采血，靜置20 min，1 006.2×g離心15 min，56℃、30 min滅活后用0.22μm濾膜過濾，得到含藥血清。對照組操作同前。

3.3 檢測血清生化指標及HYP含量按照試劑盒說明書，檢測各組大鼠血清中ALT、AST、ALP及HYP的含量。

3.4 肝組織病理學觀察選取適量肝組織（右側(cè)最厚一葉），置于4%甲醛溶液中固定48 h，梯度乙醇脫水各2 h，二甲苯透明30 min，石蠟包埋，切片厚度4μm。最后根據(jù)標準程序進行HE和Masson染色，在光學顯微鏡下觀察肝臟的病理變化。

3.5 細胞培養(yǎng)和處理取HSC-T6細胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，保存在37℃培養(yǎng)箱，濕度95%，5%CO2。待細胞貼壁并長至培養(yǎng)皿的80%～90%時，各組細胞加入2μg/L轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）孵育24 h，棄上清，用10%（low dose）、15%（medium dose）和20%（high dose）的含藥血清［7］預(yù)處理24 h，收集細胞用于進一步實驗。

3.6 細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染分組為miR-21 mimics組、miR-21 inhibitor組以及各自的無效序列對照（negative contorl，NC）組（miR-21 mimics NC組和miR-21 inhibitor NC組）。

取對數(shù)生長期的（0.5～1）×106個細胞移至24孔板，當細胞密度達到80%～90%，將4個轉(zhuǎn)染組提前配制好的riboFECTTMCP混合液加到24孔板中，輕輕混勻，重新放回37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每個轉(zhuǎn)染樣品設(shè)5個復(fù)孔。

3.7 細胞活力的測定采用MTT試劑盒檢測HSC T6細胞活力。以每孔5×103個細胞的密度接種在96孔板中，分別用不同濃度的含藥血清孵育24、48和72 h，加入10μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)。在對照孔中，將微孔板讀數(shù)器歸零，酶標儀490 nm處測量吸光度（A）值。每組設(shè)4個復(fù)孔。

3.8 纖維化及相關(guān)因子的表達

3.8.1 RT-qPCR實驗用Trizol法提取細胞總RNA，溶解 于DEPC水后 測RNA濃度。通過FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再將SuperReal熒光定量預(yù)混試劑用于qPCR分析。在7500 Fast熒光定量PCR系統(tǒng)上按照以下方案進行qPCR反應(yīng)：95℃、15 min預(yù)變性；95℃、10 s變性，60℃、32 s退火，40個循環(huán)；60℃、32 s延伸。采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)處理。所有體系分析均設(shè)3次重復(fù)。引物由上海生工生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Primer sequence for RT-qPCR

3.8.2 Western blot將含有PMSF的RIPA裂解液加到肝組織和HSC-T6細胞中，4℃、14 000×g離心10 min，收集上清液，獲得蛋白樣品用于Western blot。在變性的條件下，用8%或10% SDS-PAGE分離等量的蛋白，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫下5%脫脂牛奶在含有吐溫20的TBST緩沖液中封閉1 h，4℃Ⅰ抗過夜，次日加入Ⅱ抗孵育1 h。這些信號使用近紅外加入激光成像系統(tǒng)可視化，ImageJ分析Western blot的蛋白表達灰度值。以上實驗步驟獨立進行3次。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件繪制統(tǒng)計圖。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，樣本數(shù)用n表示。若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析；若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布和/或方差齊性，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 七味清肝散抗CCl4致大鼠肝纖維化作用

與對照組相比，模型組大鼠血清中的ALT、AST、ALP和HYP含量均顯著升高（P＜0.05）；而各劑量給藥組與模型組相比，大鼠血清中的ALT、AST、ALP和HYP含量均有不同程度的下降（P＜0.05或P＜0.01），見圖1。

Figure 1.Effects of QiweiQinggan powder on serum biochemical indexes and HYP content of rats in each group.A：ALT；B：AST；C：ALP；D：HYP.Mean±SD.n=6.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖1 七味清肝散對各組大鼠血清生化指標及HYP含量的影響

HE和Masson染色顯示，正常肝細胞排列規(guī)則、致密，以中央靜脈為中心向四周呈索狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整且界線清楚；在CCl4處理后的大鼠中，HE染色的肝組織間有大量炎癥細胞浸潤，肝細胞腫脹、壞死，肝小葉損傷明顯，Masson染色的肝組織中可見廣泛的膠原沉積。這些觀察到的組織學改變都能被七味清肝散顯著減弱，且改善的程度隨藥物劑量的增加而增加，見圖2。

Figure 2.Pathological changes of HE（A）and Masson（B）staining in liver tissue.The scale bar=50μm.圖2 肝組織HE和Masson染色病理學改變

2 七味清肝散抑制HSC-T6細胞活力

用不同劑量的含藥血清孵育HSC-T6細胞24、48和72 h后結(jié)果顯示，相同時間內(nèi)，與模型組相比，各劑量組的A值顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且給藥24 h后七味清肝散含藥血清對細胞活力的抑制率明顯高于48 h和72 h，故后續(xù)實驗給藥時間定為24 h，見圖3。

Figure 3.Effects of Qiwei-Qinggan powder-containing serum on the viability of HSC-T6 cells（A）and the inhibition rate of cells in each group at different time points（B）.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs 24 h group.圖3 七味清肝散含藥血清對HSC-T6細胞活力的影響以及不同時點各組細胞的活力抑制率

3 七味清肝散通過PTEN/PI3K/Akt信號通路抗HF的作用機制

3.1 大鼠肝組織中α-SMA、Col I、PTEN、PI3K和Akt的蛋白表達水平與對照組相比，接受CCl4處理的大鼠肝組織中α-SMA、PI3K和Akt蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；當同時給予CCl4和不同劑量的七味清肝散時，上述指標的蛋白水平均顯著下調(diào)（P＜0.01），PTEN蛋白表達水平與上述指標相反（P＜0.01）見圖4。

Figure 4.Relative protein expression levels of fibrosis-related factors in liver tissue of rats in each group.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖4 各組大鼠肝組織中纖維化相關(guān)因子的蛋白表達水平

3.2 HSC-T6細胞中α-SMA、Col I、PTEN、PI3K和Akt的蛋白表達水平與模型組相比，隨著七味清肝散含藥血清劑量的增加，HSC-T6細胞中α-SMA、Col I、PI3K和Akt的蛋白表達均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），PTEN蛋白表達顯著升高（P＜0.01），見圖5。

Figure 5.Relative protein expression levels of fibrosis-related factors in HSC-T6 cells of rats in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖5 各組HSC-T6細胞中纖維化相關(guān)因子的蛋白表達水平

4 七味清肝散下調(diào)miR-21的表達

測定HSC-T6細胞中miR-21表達的變化，結(jié)果顯示，模型組HSC-T6細胞中有miR-21的明顯表達，給予不同劑量含藥血清后，各組中miR-21表達顯著降低（P＜0.01），見圖6。

5 miR-21負向調(diào)節(jié)PTEN

與各自的NC組相比，PTEN的mRNA和蛋白表達水平被miR-21 mimics顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），而被miR-21 inhibitor顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見圖7。

6 HSC-T6細胞調(diào)控miR-21抗HF的作用機制

6.1 HSC-T6細胞轉(zhuǎn)染后α-SMA、Col I、PI3K和Akt的mRNA表達水平HSC-T6細胞miR-21mimics后α-SMA、Col I、PI3K和Akt的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01），而轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor顯著降低α-SMA、Col I、PI3K和Akt的mRNA表達水平（P＜0.05或P＜0.01），見圖8。

Figure 6.The expression level of miR-21 in HSC-T6 cells of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs model group.圖6 各組HSC-T6細胞中miR-21的表達水平

Figure 7.The mRNA（A）and protein（B）expression levels of PTEN in HSC-T6-transfected cells in each group.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs miR-21 mimics NC group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs miR-21 inhibitor NC group.圖7 各組HSC-T6轉(zhuǎn)染細胞中PTEN的mRNA和蛋白表達水平

Figure 8.The mRNA expression levels ofα-SMA（A），Col I（B），PI3K（C）and Akt（D）in HSC-T6-transfected cells in each group.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs miR-21 mimics NC group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs miR-21 inhibitor NC group.圖8 各組HSC-T6轉(zhuǎn)染細胞中α-SMA、Col I、PI3K及Akt的mRNA表達水平

6.2 HSC-T6細胞轉(zhuǎn)染后PI3K和Akt的蛋白表達水平結(jié)果顯示，與miR-21 mimics NC組相比，miR-21 mimics組中PI3K和Akt蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與miR-21 inhibitor NC組相比，miR-21 inhibitor組中PI3K和Akt蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖9。

討 論

肝臟作為人體內(nèi)最大的實體器官，受損后會發(fā)生一系列炎癥事件。隨著時間的推移，慢性炎癥導(dǎo)致HSCs活化并轉(zhuǎn)分化成肌成纖維細胞，使ECM大量堆積，最終導(dǎo)致HF的形成［13］。雖然纖維化已被視為是一種保持組織完整性的“傷口愈合”過程，但持續(xù)的慢性纖維化也可能成為新的病原，逐漸發(fā)展成為肝硬化及其他相關(guān)疾病［14］。因此迫切需要找到一種更有效、更安全的抗纖維化藥物來改善HF。在本研究中，我們確定了七味清肝散的抗HF作用。七味清肝散能顯著改善HF大鼠模型的肝功能，減輕肝組織病理改變和膠原纖維沉積，抑制HSC-T6細胞活力。

Figure 9.The protein expression levels of PI3K and Akt in HSC-T6-transfected cells in each group.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs miR-21 mimics NC group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs miR-21 inhibitor NC group.圖9 各組HSC-T6轉(zhuǎn)染細胞中PI3K及Akt蛋白表達水平

HSCs活化是分泌ECM蛋白和形成肌成纖維細胞的主要細胞來源，是肝纖維化的主要驅(qū)動力。來自受損上皮細胞、纖維化組織微環(huán)境、免疫和全身代謝失調(diào)、腸道菌群失調(diào)和肝炎病毒產(chǎn)物的旁分泌信號可直接或間接誘導(dǎo)HSCs活化［15］。而失調(diào)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞應(yīng)激反應(yīng)通過誘導(dǎo)恢復(fù)到滅活狀態(tài)、細胞衰老、細胞凋亡以及免疫細胞清除是HSCs失活的候選靶標［16］。在本研究中，我們主要探討了PTEN/PI3K/Akt信號通路在HF中的作用。研究表明［17］，PI3K/Akt信號通路中的一系列磷酸化事件可能會激活轉(zhuǎn)錄因子，參與和改變重要細胞過程（增殖、分化）的蛋白表達、細胞凋亡、細胞周期和血管生成等，所以下調(diào)PI3K和Akt的表達，可能有利于疾病治療。而PTEN作為PIEK/Akt通路的天然抑制劑，可抑制PI3K/Akt信號通路的激活，限制細胞增殖和腫瘤進展［18］。同時，有大量文獻報道PI3K/Akt信號通路能夠有效調(diào)節(jié)纖維化反應(yīng)，譬如ECM的重塑和肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化；下調(diào)PI3K、Akt和mTOR等可抑制膠原表達，阻斷成纖維細胞的增殖、分化，延緩纖維化疾病的進展［19］。在我們的研究結(jié)果中，七味清肝散就是通過上調(diào)PTEN，下調(diào)α-SMA、collagen I、PI3K和Akt表達來發(fā)揮抗HF作用。

研究證實miRNA的上、下調(diào)表達影響HF的發(fā)病機制［20］。在本研究，我們聚焦于miR-21，揭示了七味清肝散能通過miR-21影響PTEN/PI3K/Akt信號通路來抗HF。研究顯示［21-22］，PTEN是miR-21的下游靶標，兩者呈負向調(diào)控，而活化的HSC-T6細胞中miR-21明顯上調(diào)，這與已有的研究結(jié)果一致，七味清肝散降低了HSCs中miR-21表達。此外，細胞轉(zhuǎn)染實驗顯示，在mRNA和蛋白水平上，miR-21 mimics抑制PTEN的表達，上調(diào)PI3K和Akt表達，而miR-21 inhibitor對PTEN/PI3K/Akt通路的影響與七味清肝散類似。

綜上所述，本實驗通過動物和細胞模型初步探討了七味清肝散具有抗大鼠HF作用，其作用機制可能是通過下調(diào)miR-21，進而調(diào)控PTEN/PI3K/Akt信號通路來實現(xiàn)的，為七味清肝散在HF中的臨床應(yīng)用提供了參考資料。