潘錦超，劉獻，高敬，3，湯響林△，高月△

（1廣東藥科大學，廣東 廣州 510006；2軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850；3河南大學，河南 開封 475004）

我國是世界上高原地區(qū)面積最大、平均海拔最高、定居人口最多的國家。每年有大約1億人因各種原因前往高海拔地區(qū)［1］。高海拔地區(qū)低壓缺氧及強紫外線的環(huán)境對從平原來到高原的人群產(chǎn)生不適影響，許多人會出現(xiàn)頭痛、胸悶、乏力等輕微癥狀，嚴重者會患急性高原病。因此探究高原低壓缺氧對機體損傷的機制已成為研究熱點。目前低壓缺氧對機體的損傷研究大多集中在腦、肺以及心臟方面，但對缺氧同樣敏感的腎臟這一器官，高原缺氧對其功能損傷的研究仍有欠缺。已有的文獻證明急性高原缺氧能夠?qū)е录毙阅I損傷［2］，并且持續(xù)的急性腎損傷會導致急性腎功能衰竭或慢性腎病，因此需要盡早發(fā)現(xiàn)急性腎損傷并進行治療。在目前已有的高原急性腎損傷研究中，用來評價腎損傷的指標主要集中在血清肌酐（serum creatinine，SCr）［3-4］、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）［5-6］、尿中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）［4，7］、尿腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）［3，8］、尿白細胞介素18（interleukin-18，IL-18）、尿Na+/H+交換蛋白3（Na+/H+exchanger 3，NHE3）［9］等。然而，已有研究僅局限于單一的海拔高度，對不同海拔高度腎臟損傷情況尚不清楚。另外，傳統(tǒng)的SCr僅在腎小球濾過率下降超過50%才會顯著降低，因此不能及時反映腎臟功能的變化。除NGAL和KIM-1外，目前的臨床研究也證明了其他幾種生物標志物如肝型脂肪酸結合蛋白（liver-type fatty acid-binding protein，L-FABP）、金屬蛋白酶組織抑 制 因 子2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）和胰島素樣生長因子結合蛋白7（insulinlike growth factor binding protein 7，IGFBP7）均能很好地評價急性腎損傷，然而在動物水平上的評價作用研究較少。因此，本研究通過模擬不同海拔高度，觀察低、中、高三個不同海拔高度下大鼠腎臟的損傷程度，以及L-FABP、TIMP-2和IGFBP7在大鼠腎臟中的表達情況，旨在探究潛在新型標志物在大鼠不同程度高原腎損傷中的變化情況，同時對三種新型腎損傷標志物的靈敏度進行評價，為新型標志物在高原腎臟損傷及其他腎臟疾病中的應用提供依據(jù)。

材料和方法

1 實驗儀器及試劑

動物低壓氧艙（貴州風雷航空軍械有限公司）；血細胞分析儀（Sysmex）；生化分析儀（Hitachi）；酶標儀（PerkinElmer）；Heraeus高速冷凍離心機（Thermo Scientific）。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號：MM-0386R1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（貨號：MM-0180R1）、L-FABP試 劑 盒（貨號：MM-70115R1）、TIMP-2試劑盒（貨號：MM-0127R1）和IGFBP7試劑盒（貨號：MM-70148R1）均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司。

2 實驗方法

2.1 實驗動物及分組8周齡健康SPF級SD大鼠64只，雌雄各半，體重180～200 g，均購自北京維通利華公司［生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011］。動物飼養(yǎng)1周后開始實驗，將大鼠隨機分為高原缺氧組和對照組，高原缺氧組又分為海拔3 500 m組、海拔4 500 m組及海拔5 500 m組，每組16只。

2.2 模型制備將3 500 m組大鼠于第1天上午8：00置于低壓氧艙中，連續(xù)缺氧72 h；于第3天晚8：00對大鼠禁食處理，第4天上午8：00將大鼠從低壓氧艙中取出，同時將4 500 m組大鼠置于低壓氧艙中；于第6天晚8：00對大鼠禁食處理，第7天上午8：00將大鼠從低壓氧艙中取出，同時將5 500 m組大鼠置于低壓氧艙中；于第9天晚8：00對大鼠禁食處理，第10天上午8：00將大鼠從低壓氧艙中取出。對照組大鼠在常壓常氧環(huán)境下飼養(yǎng)。實驗期間各組大鼠自由進食飲水。高原缺氧組大鼠從低壓氧艙中取出后立即注射10%水合氯醛進行麻醉，迅速剪開腹腔取腹主動脈血和雙側腎臟。對照組大鼠與海拔5 500 m組大鼠在同一時段內(nèi)取材。

2.3 血細胞含量測定取部分腹主動脈血裝入抗凝管中，用血細胞分析儀測大鼠全血中血細胞含量。

2.4 SCr、BUN、血清尿酸（uric acid，UA）含量測定剩余血液裝入不含抗凝劑的EP管中，室溫放置2 h后于4℃、2 012.4×g離心15 min，取一部分上清液用生化分析儀檢測SCr、BUN和血清UA含量。

2.5 腎組織SOD、TNF-α、L-FABP、TIMP-2和IGFBP7水平測定取部分右腎放入2 mL EP管中，加入預冷的PBS，用組織勻漿機勻漿，離心取上清液，按試劑盒說明書檢測各指標。

2.6 腎臟組織病理染色取左腎，縱向切開，切取1 cm×1 cm×1 cm大小組織塊放入4%多聚甲醛固定液中固定，脫水包埋、切片，分別進行HE染色及Masson染色后置于光學顯微鏡下觀察腎組織病理情況。

3 統(tǒng)計學方法

用GraphPad Prism 8.0.2軟件統(tǒng)計并繪圖。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 大鼠血細胞含量變化

對各組大鼠外周血象數(shù)據(jù)進行分析，結果見圖1。與對照組相比，高原缺氧組大鼠全血中紅細胞（red blood cell，RBC）計數(shù)和紅細胞比容（hematocrit，HCT）均有一定升高，其中4 500 m組和5 500 m組有顯著差異（P＜0.01），血紅蛋白（hemoglobin，HGB）含量和網(wǎng)織紅細胞（reticulocyte，RET）計數(shù)均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

Figure 1.Changes of blood cells in rats at different altitudes.A：changes of red blood cell（RBC）count in each group；B：changes of hemoglobin（HGB）content in each group；C：changes of hematocrit（HCT）in each group；D：changes of reticulocyte（RET）count in each group.Mean±SD.n=16.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control（NC）group.圖1 不同海拔高度下大鼠血細胞變化情況

2 SCr、BUN和血清UA含量變化

與對照組相比，高原缺氧組大鼠SCr含量均有所升高，其中4 500 m組和5 500 m組顯著升高（P＜0.01）；3 500 m組大鼠BUN含量與對照組相比有升高趨勢，5 500 m組顯著升高（P＜0.05）；與對照組相比，僅4 500 m組大鼠血清UA含量顯著升高（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.Changes of serum creatinine（SCr），blood urea nitrogen（BUN）and serum uric acid（UA）levels in rats at different altitudes.A：changes of SCr content in each group；B：changes of BUN content in each group；C：changes of serum UA content in each group.Mean±SD.n=16.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control（NC）group.圖2 不同海拔高度下大鼠SCr、BUN和血清UA含量變化

3 腎組織中SOD、TNF-α、L-FABP、TIMP-2和IGFBP7水平

與對照組相比，高原缺氧組大鼠腎組織中SOD活性均顯著降低（P＜0.05），其中5 500 m組降低更為顯著（P＜0.01）；高原缺氧組大鼠腎組織中TNF-α含量均顯著升高（P＜0.01）；大鼠腎組織中L-FABP、TIMP-2和IGFBP7含量均隨海拔高度的增加而逐漸升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。

4 腎組織HE染色結果

HE染色顯示，對照組大鼠腎組織結構正常，腎皮質(zhì)內(nèi)可見大量毛細血管纏繞形成的腎小球，腎小球間質(zhì)內(nèi)排列大量腎小管，腎皮質(zhì)與髓質(zhì)界限清晰，髓質(zhì)內(nèi)分布大量集合管，組織形態(tài)結構正常，未見明顯病理改變；與對照組相比，3 500 m組大鼠腎組織中部分腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，部分腎小管上皮細胞水腫，細胞腫脹、胞質(zhì)淡染；4 500 m組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)內(nèi)部分腎小管上皮細胞水腫，細胞腫脹、胞質(zhì)淡染，部分腎小管上皮細胞刷狀緣脫落；5 500 m組大鼠腎組織內(nèi)大量腎小管出現(xiàn)損傷，上皮細胞水腫，細胞腫脹、胞質(zhì)淡染，部分腎小球萎縮，球內(nèi)毛細血管數(shù)量減少，且可見明顯腎小球分葉現(xiàn)象。腎組織病理評分結果顯示，高原缺氧組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖4。

Figure 3.Changes of superoxide dismutase（SOD），tumor necrosis factor-α（TNF-α），liver-type fatty acid-binding protein（LFABP），tissue inhibitor of metalloproteinase-2（TIMP-2）and insulin-like growth factor binding protein 7（IGFBP7）levels in kidney tissue of rats at different altitudes.A：changes of SOD activity in each group；B：changes of TNF-αcontent in each group；C：changes of L-FABP content in each group；D：changes of TIMP-2 content in each group；E：changes of IGFBP7 content in each group.Mean±SD.n=16.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control（NC）group.圖3 不同海拔高度下大鼠腎組織中SOD、TNF-α、L-FABP、TIMP-2和IGFBP7水平的變化

5 腎組織Masson染色結果

Masson染色顯示，對照組大鼠腎組織結構無顯著纖維化情況，高原缺氧組大鼠腎組織出現(xiàn)顯著纖維化變化；計算膠原纖維面積百分比結果顯示，由于3 500 m組和5 500 m組大鼠組內(nèi)存在個體差異，因此僅4 500 m組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖5。

討 論

目前已知高原低壓缺氧環(huán)境能夠?qū)π呐K、腦、肺造成損傷，對腎臟功能影響的報道較少。研究表明急進高原早期健康人群腎臟功能有一定改變，表現(xiàn)為尿IL-18、尿NAGL、尿KIM-1、BUN、SCr、血UA和血cystatin C水平的變化［6，8］，提示腎小球濾過、腎小管重吸收和分泌功能受到損傷，且隨海拔高度的增加而加重。由于腎臟的代償作用，這種損傷會隨缺氧時間的延長而減弱［10］。目前對高原腎損傷的動物實驗研究往往停留在單一海拔高度，且評價腎損傷的標志物靈敏度較差。因此本研究評價了新型腎損傷標志物在評價動物水平高原腎損傷中的靈敏度，為其在動物腎臟疾病研究的應用提供科學依據(jù)。

本研究結果表明：缺氧后大鼠全血中紅細胞、血紅蛋白、網(wǎng)織紅細胞含量及紅細胞比容較對照組有不同程度升高，這表明隨海拔的升高，大鼠全血中與攜氧能力有關的血細胞與蛋白呈現(xiàn)出梯度的升高趨勢。急性低壓缺氧后，大鼠腎組織中炎癥因子（TNFα）含量增加。炎癥在許多高原疾病中都有參與，雖然目前尚不清楚其具體作用機制，但在其他能夠產(chǎn)生低氧微環(huán)境的疾病中，已被證明HIF-1α具有調(diào)節(jié)炎癥反應［11-13］，加重炎癥損傷的功能［14］。另外，炎癥因子能夠通過NF-κB通路激活HIF［15-18］，進而調(diào)控HIF下游蛋白的表達。氧化應激是機體產(chǎn)生ROS的含量超過抗氧化能力時的一種狀態(tài)［19］。缺氧能夠通過HIF-1α/NOX4通路積累ROS［20］，造成氧化應激，本研究結果顯示低壓缺氧后大鼠腎組織中SOD含量減少，大鼠抵抗氧化應激能力減弱。一直以來，腎小球濾過率都被認為是評價腎臟健康與否的黃金指標［21］，而SCr常作為估計腎小球濾過率的重要指標［22］。目前臨床經(jīng)常使用SCr或BUN來作為評價腎損傷的指標，然而這兩者的值往往在腎小球濾過率低于50%時才會發(fā)生顯著升高，并且BUN受疾病、飲食等因素影響較大，因此用SCr與BUN診斷早期腎臟損傷很可能是不準確的。尋找更靈敏的評價腎臟損傷的標志物是十分重要的。

Figure 4.Pathological changes of kidneys in rats at different altitudes（HE staining，scale bar=100μm）.A：normal control group；B：3 500 m group［part of renal tubular epithelial cells with brush border exfoliation（black arrow），and some renal tubular epithelial cell edema（red arrow）］；C：4 500 m group［edema of some renal tubular epithelial cells（green arrow）and brush margin exfoliation of some renal tubular epithelial cells（black arrow）］；D：5 500 m group［edema of renal tubular epithelial cells（red arrow），atrophy of some glomeruli，reduction of intraglomerular capillaries，and glomerular paging（black arrow）］.Mean±SD.n=16.*P＜0.05，**P＜0.01 vs A.圖4 不同海拔高度下大鼠腎臟病理形態(tài)變化（HE染色）

Figure 5.Renal pathomorphological changes（Masson staining，scale bar=100μm）in each group at different altitudes.A：normal control group；B：3 500 m group；C：4 500 m group；D：5 500 m group.Mean±SD.n=16.*P＜0.05，**P＜0.01 vs A.圖5 不同海拔高度下大鼠腎臟病理形態(tài)變化（Masson染色）

L-FABP是哺乳動物細胞內(nèi)脂肪酸結合蛋白家族的成員，它在調(diào)節(jié)脂肪酸新陳代謝和細胞內(nèi)運輸方面起著至關重要的作用［23］。除了在肝臟中表達外，它在腎臟近端腎小管上皮細胞中也有表達，并在腎小管損傷時分泌到尿液中［24］。臨床研究表明，心血管手術患者術后尿L-FABP值對其是否會發(fā)生急性腎損傷具有較好的預測作用［23］。另外，研究表明，F(xiàn)ABP1基因啟動子區(qū)域含有缺氧反應元件［25］，在腎小管遭受缺血缺氧時FABP1分泌增多，因此FABP1可以作為一個表征缺氧性腎臟損傷的指標。

TIMP-2是腎組織遠端小管表達并分泌的一種物質(zhì)［26］，是一種細胞周期阻滯蛋白，已被證明TIMP-2與α3β1整合素結合，使細胞停留在G1期，從而抑制內(nèi)皮細胞增殖［27］。IGFBP7主要在近端小管表達［26］，其能夠在腎小管上皮細胞受到損傷后以自分泌和旁分泌的方式釋放并作用于未受到損傷的細胞，通過調(diào)控p53和p21的表達來阻斷細胞周期的進程［28］。這兩者均能夠在腎小管細胞損傷的早期階段釋放并參與G1期停滯［29］。已有的臨床研究也表明TIMP-2與IGFBP7對患者發(fā)生急性腎損傷的預測作用優(yōu)于其他生物標志物［28］。因此這3種物質(zhì)在能夠急性腎損傷早期起到預測作用，且較SCr有更好的敏感性，然而它們在動物水平腎損傷的預測作用研究較少。

在本研究中，與對照組相比，高原缺氧組大鼠SCr及腎組織L-FABP、TIMP-2和IGFBP7含量升高，提示高原缺氧能夠降低大鼠腎小球濾過率，造成急性腎損傷；高原缺氧組各組之間相比，腎臟病理變化隨海拔高度增加逐漸明顯。與4 500 m組及5 500 m組相比，3 500 m組大鼠腎臟損傷程度相對較小，SCr變化較少，然而TIMP-2和IGFBP7含量在3 500 m組就已發(fā)生顯著升高。這提示TIMP-2和IGFBP7較SCr靈敏度更佳，在病理形態(tài)尚未出現(xiàn)明顯改變時可提示損傷的發(fā)生，而L-FABP的靈敏度較TIMP-2和IGFBP7稍差，僅在海拔4 500 m時發(fā)生明顯升高。BUN與血清UA含量并未隨海拔高度的升高逐漸增多，推測可能是其他因素影響了這兩者含量的變化。

在高原缺氧導致的大鼠腎臟損傷中，氧化應激和炎癥似乎參與了這一進程，然而在病理結果上并未出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤，因此關于高原缺氧導致的腎臟損傷機制需要進一步研究。另外，本實驗是基于健康大鼠，對于患有糖尿病腎病、高血壓或其他腎功能不良的大鼠，高原缺氧能否加重其腎臟功能損傷，還有待進一步研究。在健康人水平上，由于急進高原初期健康人腎臟功能有一定改變，因此初上高原1周內(nèi)，要密切關注高原駐防官兵的腎臟功能，對于出現(xiàn)腎臟相關指標異常的官兵，要及時給予糾正，以免損傷加重。另外在相關藥物的使用方面要注意藥量的調(diào)整，避免發(fā)生由于藥量過高產(chǎn)生的毒副作用。