余施雷，李娟，楊婷，黃世光△

（1杭州牙科醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632）

牙周炎（periodontitis）是牙周?。╬eriodontal diseases）的主要疾病類型之一，這是一種緩慢進(jìn)展的發(fā)生在牙周軟硬組織上的炎癥性破壞性疾病，最終結(jié)局是牙齒病理性松動脫落，喪失咀嚼功能。CD68是單核/巨噬細(xì)胞的可靠標(biāo)記，研究報(bào)道在慢性牙周炎中觀察到CD68+細(xì)胞的表達(dá)均較單純牙齦炎患者增多；而侵襲性牙周炎組織中其表達(dá)量又多于慢性牙周炎組織［1-3］。

親環(huán)素A（cyclophilin A，CypA）是由單核/巨噬細(xì)胞、活化血小板及內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的促炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)各種細(xì)胞類型的炎癥反應(yīng)［1，4］；還可促進(jìn)白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等分泌，加重炎癥反應(yīng)［5］。目前研究顯示，CypA可在慢性牙周炎患者牙齦組織、齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）及唾液中檢測到，且其表達(dá)水平高于健康牙齦組織［6］。CD147是免疫球蛋白家族的一員，能夠在單核/巨噬細(xì)胞表面表達(dá)，并且可作為CypA的表面受體［7］。研究者在人健康及炎癥牙齦組織、GCF及唾液中檢測到CD147存在，但其表達(dá)水平在炎癥組織中較高［8］。基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞等生成，可降解明膠和IV，V，IX型等膠原纖維，其過量表達(dá)能夠促進(jìn)疾病中細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在牙周軟硬組織破壞中起到關(guān)鍵作用［9-10］。

目前CypA/CD147對MMP-2的調(diào)控作用及三者在人慢性牙周炎CD68+細(xì)胞上的表達(dá)及臨床意義尚未闡明，我們推測CypA與CD147相互作用產(chǎn)生的結(jié)果可能是促進(jìn)體外MMP-2含量增多，通過促使破骨細(xì)胞行使破壞功能、加重臨床癥狀如牙槽骨破壞等來參與人牙周炎病變的發(fā)展。本研究通過觀察CypA、CD147及MMP-2在CD68+細(xì)胞的表達(dá)情況，探討CD68+細(xì)胞CypA、CD147及MMP-2在不同程度牙周炎組織中的作用及作用機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

Mouse CD68抗體（M0814，Dako Denmark A/S）；抗CypA抗體（bs-5912R，北京博奧森生物公司）；抗CD147抗體（bs-0684R，北京博奧森生物公司）；抗MMP-2抗體（bs-4599R，北京博奧森生物公司）；CY3（山羊抗鼠）（GB21301，武漢賽維爾生物科技有限公司）；FITC（山羊抗兔）（GB22303，武漢賽維爾生物科技有限公司）；DAPI（G1012，武漢賽維爾生物科技有限公司）；BSA（G5001，武漢賽維爾生物科技有限公司）；Ⅱ抗試劑盒（Dako Denmark A/S）；DAB顯色試劑盒（ZLI-9019，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。普通光學(xué)顯微鏡（Leica）；熒光顯微鏡和成像系統(tǒng)（Nikon）。

2 方法

2.1 病例選擇選擇2019年7月～2020年6月就診于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院及中山市人民醫(yī)院口腔科且自愿接受本研究的60例患者（年齡16～68歲）納入本實(shí)驗(yàn)，其中男32例，平均年齡（37±14）歲；女28例，平均年齡（35±15）歲。根據(jù)Armitage等［11］牙周病分類指南為標(biāo)準(zhǔn)，評定分組項(xiàng)目的檢查均由同一名醫(yī)生完成，檢查包括牙齦指數(shù)（gingival index，GI）、探診深度（probing depth，PD）和附著喪失（attachment loss，AL），影像學(xué)觀察牙槽骨吸收程度。按要求分為4組，每組15例。每組患者年齡、性別差異無意義（P＞0.05）。所有選取女性患者均否認(rèn)懷孕、服用長效或短效避孕藥病史，少數(shù)患者或患有心血管或其他系統(tǒng)性疾病，并且至少三個(gè)月內(nèi)未服用抗生素治療。研究方案經(jīng)暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院及中山市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。告知每位患者實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并簽署知情同意書。在進(jìn)行牙周治療前，獲取牙齦組織標(biāo)本。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組健康對照組（15例）：牙周健康的正畸牙或智齒。GI=0，PD≤3 mm，AL=0，X線觀察牙槽骨無明顯吸收。

輕度慢性牙周炎組（15例）：種植手術(shù)拔除的需行冠延長術(shù)或牙周翻瓣術(shù)的患牙。GI=1，PD≤4 mm，AL=1～2 mm，X線觀察牙槽骨吸收小于根長1/3。

中度慢性牙周炎組（15例）：需行牙周手術(shù)采用內(nèi)斜切口患牙。GI=2～3，PD=（4～6）mm，AL=（3～5）mm，X線觀察牙槽骨吸收1/3≤根長＜1/2。

重度慢性牙周炎組（15例）：無法保留或預(yù)后差的需拔除的患牙。GI=3，PD＞6 mm，AL≥5 mm，X線觀察牙槽骨吸收1/2≤根長＜2/3。

2.3 組織標(biāo)本采集、處理牙齦組織標(biāo)本置于10%中性福爾馬林固定液中浸泡24～48 h，制作5μm厚度的連續(xù)切片。HE染色后的由兩名病理醫(yī)師在光鏡下盲法觀察組織學(xué)表達(dá)情況后評分，參照Huang等［12］牙齦炎癥程度評分標(biāo)準(zhǔn)（0～3分），取兩人評分均值。

2.4 CD68-CypA、CD68-CD147及CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞免疫熒光雙染色CD68陽性信號在胞質(zhì)及胞膜呈現(xiàn)紅光，CypA、CD147以及MMP-2陽性信號在胞質(zhì)及胞膜呈現(xiàn)綠光，DAPI核染紫外激發(fā)為藍(lán)色，同一視野下CD68-CypA、CD68-CD147以及CD68-MMP-2陽性重疊后呈見黃光。切片于400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（0.0768 mm2/視野），對每個(gè)視野DAPI陽性及表達(dá)CD68-CypA、CD68-CD147或CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)取均值，根據(jù)所測面積計(jì)算單位面積雙陽性細(xì)胞密度（cells/mm2）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 Statistics進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），設(shè)α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

（1）牙齦評分?jǐn)?shù)據(jù)選擇多獨(dú)立樣本比較（Kruskal-WallisH檢驗(yàn)）分析各組評分是否存在差異性；當(dāng)P＜0.05時(shí)，再對4個(gè)組別樣本進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)各個(gè)組別間的差異性。

（2）4組標(biāo)本的CD68-CypA、CD68-CD147、CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞密度樣本均數(shù)間差別的比較采用One-way ANOVA（本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Levene法檢驗(yàn)后顯示方差不齊，選取Tamahane"s T2法）。

（3）采用Pearson分析各組CD68-CypA、CD68-CD147、CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞密度與慢性牙周炎炎癥程度評分間關(guān)系。

（4）采用Pearson分析各組CD68-CypA、CD68-CD147雙陽性細(xì)胞密度與CD68-MMP2雙陽性細(xì)胞密度間關(guān)系。

結(jié) 果

1 各組HE染色結(jié)果

健康組：結(jié)構(gòu)無明顯異常，多為膠原纖維分布，上皮及固有層內(nèi)未觀察到明顯炎癥細(xì)胞浸潤。輕度組：溝內(nèi)上皮下方少量炎癥細(xì)胞浸潤，膠原纖維變性。中度組：溝內(nèi)上皮下方炎癥細(xì)胞浸潤多于輕度，漿細(xì)胞增多，纖維結(jié)締組織增生，膠原纖維變性。重度組：上皮釘突伸長至結(jié)締組織，見大量炎癥細(xì)胞浸潤，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞散在分布，膠原纖維水解變性（見圖1A）。

各組炎癥評分比較見圖1B、C，統(tǒng)計(jì)分析顯示：與健康組的牙齦組織炎癥程度評分相比，慢性牙周炎組牙齦組織的評分顯著升高（P=0.000）；不同炎癥程度牙周炎組間的評分亦存在顯著差異（P＜0.01），評分隨炎癥程度加重而增加。

Figure 1.Histology of human tissues in the 4 groups.A：HE staining（scale bars=50μm），collagen fibers were mostly distributed in healthy group and inflammatory cell gradually increased in periodontitis groups；B：inflammation score distribution；C：comparison of inflammation score.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.圖1 各組病理學(xué)結(jié)果

2 CD68-CypA DIF染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中CD68-CypA雙陽性細(xì)胞染色結(jié)果見圖2A。健康組中CD68-CypA雙陽性細(xì)胞幾乎無表達(dá)，細(xì)胞上特異性黃色重疊熒光幾乎未觀察到；輕度組中CD68-CypA雙陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量稍有增加，見少量細(xì)胞上有特異性黃色重疊熒光表達(dá)；中度組中存在許多CD68-CypA雙陽性細(xì)胞，見較多細(xì)胞上有特異性黃色重疊熒光表達(dá)；重度組中見大量CD68-CypA雙陽性細(xì)胞，大量細(xì)胞上有特異性黃色重疊熒光表達(dá)。

計(jì)算CD68-CypA雙陽性細(xì)胞密度后各組間比較（見圖2B、C），統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：CD68-CypA雙陽性細(xì)胞密度在健康組及各組牙周炎牙齦組織中存在顯著差異（F=308.892，P＜0.01），各個(gè)組別間比較結(jié)果為：輕度組的雙陽性細(xì)胞密度高于健康組（P＜0.01），中度高于輕度組（P＜0.01），重度高于輕、中度組（P＜0.01）。

Figure 2.The relevant data of CD68-CypA double-positive cells.A：DIF staining（scale bars=50μm），almost no expression of double-positive cells in healthy group and the double-positive cells gradually increased in periodontitis groups；B：CD68-CypA double-positive cell density distribution；C：analyze of CD68-CypA double-positive cell density expression.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.圖2 CD68-CypA DIF染色結(jié)果

3 CD68-CD147 DIF染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中CD68-CD147雙陽性細(xì)胞染色結(jié)果見圖3A。健康組中CD68-CD147雙陽性細(xì)胞幾乎無表達(dá)，細(xì)胞上特異性黃色重疊熒光幾乎未觀察到；輕度組中CD68-CD147雙陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量稍有增加，見少量細(xì)胞上有特異性黃色重疊熒光；中度組中存在許多CD68-CD147雙陽性細(xì)胞，見較多細(xì)胞上特異性黃色重疊熒光表達(dá)；重度組中存在大量CD68-CD147雙陽性細(xì)胞，大量細(xì)胞上有特異性黃色重疊熒光表達(dá)。

計(jì)算CD68-CD147雙陽性細(xì)胞密度后各組間比較（見圖3B、C），統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：CD68-CD147雙陽性細(xì)胞密度在健康組及各組牙周炎牙齦組織中存在顯著差異（F=403.264，P＜0.01），各個(gè)組間比較結(jié)果為：輕度組的雙陽性細(xì)胞密度高于健康組（P＜0.01）；中度高于輕度組（P＜0.01）；重度高于輕、中度組（P＜0.01）。

Figure 3.The relevant data of CD68-CD147 double-positive cells.A：DIF staining（scale bars=50μm），almost no expression of double-positive cells in healthy group and the double-positive cells gradually increased in periodontitis groups；B：CD68-CD147 double-positive cell density distribution；C：analyze of CD68-CD147 double-positive cell density expression.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.圖3 CD68-CD147 DIF染色結(jié)果

4 CD68-MMP-2 DIF染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞染色結(jié)果見圖4A。健康組中CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞少幾乎無表達(dá)，特異性黃色熒光幾乎未觀察到；輕度組中CD68-MMP-2雙陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量稍有增加，見少量細(xì)胞上有特異性黃色重疊熒光表達(dá)；中度組中存在許多CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞，見較多細(xì)胞上有特異性黃色重疊熒光陽性表達(dá)；重度組中存在大量CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞，大量細(xì)胞上有特異性黃色重疊熒光表達(dá)。

計(jì)算CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞密度后各組間比較（見圖4B、C），統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞密度在健康組及各組牙周炎牙齦組織中存在顯著差異（F=254.419，P＜0.01），各個(gè)組間比較結(jié)果為：輕度組雙陽性細(xì)胞密度高于健康組（P＜0.01）；中度高于輕度組（P＜0.01）；重度高于輕、中度組（P＜0.01）。

Figure 4.The relevant data of CD68-MMP-2 double-positive cells.A：DIF staining（scale bars=50μm），almost no expression of double-positive cells in healthy group and the double-positive cells gradually increased in periodontitis groups；B：CD68-MMP-2 double-positive cell density distribution；C：analyze of CD68-MMP-2 double-positive cell density expression.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.圖4 CD68-MMP-2 DIF染色結(jié)果

5 相關(guān)性分析結(jié)果

根據(jù)Pearson相關(guān)分析結(jié)果可得，CD68-CypA雙陽性細(xì)胞的相關(guān)系數(shù)：r=0.959，P=0.000；CD68-CD147雙陽性細(xì)胞的相關(guān)系數(shù)：r=0.948，P=0.000，CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞的相關(guān)系數(shù)：r=0.945，P=0.000（圖5）；表明CD68-CypA雙陽性細(xì)胞、CD68-CD147雙陽性細(xì)胞及CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞密度和牙周炎炎癥程度呈正相關(guān)。

根據(jù)Pearson相關(guān)分析結(jié)果可得，各組中CD68-CypA雙陽性表達(dá)水平與CD68-MMP-2呈正相關(guān)（r=0.933，P=0.000）；CD68-CD147雙陽性表達(dá)與CD68-MMP-2雙陽性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.954，P=0.000），見圖6；表明CD68-CypA和CD68-CD147雙陽性表達(dá)均與CD68-MMP2雙陽性表達(dá)水平呈正相關(guān)。

討 論

牙周炎的病理特征是牙齒周圍支持組織的破壞，雖然目前關(guān)于牙周炎的免疫應(yīng)答機(jī)制已經(jīng)各方面反復(fù)進(jìn)行的研究，但在引起牙周組織感染的細(xì)胞因子以及相關(guān)的免疫機(jī)制仍未明確。在本研究中，以CD68+作為單核/巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物，通過免疫熒光染色法觀察到CD68+的表達(dá)水平在炎癥牙齦組織中增多，對比各組間數(shù)據(jù)可見其表達(dá)量隨炎癥程度升高而顯著增多，與國內(nèi)外的研究結(jié)果基本相符［1-3］。該結(jié)果提示，單核/巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平可以反映出慢性牙周炎的炎癥程度以及牙周組織臨床破壞的程度，其量化標(biāo)準(zhǔn)具有一定的參照意義，再次印證單核/巨噬細(xì)胞的表達(dá)是判斷牙周炎癥的其中一項(xiàng)指標(biāo)。

Figure 5.The Pearson analysis of CD68-CypA，CD68-CD147 and CD68-MMP-2 double-positive cell density and the severity of periodontitis.Pearson correlation of CD68-CypA double-positive cell density is r=0.959，P=0.000；CD68-CD147 double-positive cell density is r=0.948，P=0.000；CD68-MMP-2 double-positive cell density is r=0.945，P=0.000.圖5 Pearson相關(guān)性分析

Figure 6.The Pearson analysis of CD68-CypA，CD68-CD147 and CD68-MMP-2 double-positive cell density and the severity of periodontitis.Pearson correlation of CD68-CypA double-positive cell density and CD68-MMP-2 double-positive cell density is r=0.933，P=0.000；CD68-CD147 double-positive cell density and CD68-MMP-2 double-positive cell density is r=0.954，P=0.000.圖6 CD68-CypA、CD68-CD147雙陽性表達(dá)與CD68-MMP-2雙陽性水平呈正相關(guān)

CypA作為促炎細(xì)胞因子，不僅可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)，還可加重炎癥反應(yīng)［4-5］。在人慢性牙周炎牙齦組織上觀察到CypA和CD147的表達(dá)高于健康牙齦，且與CD68+細(xì)胞定位高度重合［8，13-16］。在本研究中，我們觀察到CypA的表達(dá)與牙周炎的炎癥程度正相關(guān)，驗(yàn)證了CypA在牙周炎癥組織中的重要作用［15-16］。本研究通過免疫雙熒光染色觀察到CD68與CypA、CD68與CD147共定位，牙周炎組中雙陽性細(xì)胞密度高于健康組，且計(jì)算得到其雙陽性細(xì)胞密度與牙周炎癥程度呈正比，間接提示CypA和CD147可能通過趨化單核/巨噬細(xì)胞參與牙周炎病程，這與目前的研究報(bào)道相符［6，15-17］。

機(jī)體在正常生理狀態(tài)下，MMPs低水平表達(dá)以維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)；當(dāng)病理情況下，其表達(dá)水平與激活狀態(tài)增高，在牙周炎中表現(xiàn)為降解破壞牙周組織細(xì)胞外基質(zhì)，MMP-2是參與組織動態(tài)平衡與重塑的MMPs之一，具有一定的促炎作用［18-19］。在本研究中，觀察到MMP-2在健康牙齦組織中可有少量表達(dá)，炎癥組織中表達(dá)增多；CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞表達(dá)量與牙周炎癥水平呈正相關(guān)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中CypA、CD147和MMP-2在炎癥組織中的表達(dá)情況，提示CypA及CD147可能對MMP-2存在正向調(diào)控作用，在CypA/CD147復(fù)合體的作用下牙周炎癥加重，并且可能對MMP-2表達(dá)有促進(jìn)作用，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們通過DIF法觀察到CD68-CypA雙陽性細(xì)胞、CD68-CD147雙陽性細(xì)胞及CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞在人健康及慢性牙周炎牙齦組織中均有不同程度表達(dá)，提示在CD68+細(xì)胞上CypA、CD147可能對MMP-2的表達(dá)有促進(jìn)作用，且CD68-CypA、CD68-CD147及CD68-MMP-2雙陽性細(xì)胞可能參與牙周組織的降解破壞，并在與其他細(xì)胞因子協(xié)助下加重牙周炎癥的進(jìn)展，因此調(diào)控MMP-2的水平有望成為防治牙周炎的潛在研究方向，然而由于CypA/CD147相互作用復(fù)雜，對于其相互作用及對MMP-2的調(diào)控的具體機(jī)制尚需深入探究。