夏崇建，黃俊杰，張煜，卓嘉英，吳娟娟，陳剛，范琰琰

（溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，在中國(guó)成人中發(fā)病率高，可引起多種并發(fā)癥［1-3］。其中，糖尿病患者的傷口難以愈合已成為醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)問題之一［3］。傷口內(nèi)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)傷口炎癥期向增殖期過渡的關(guān)鍵細(xì)胞，在炎癥期它們極化為M1表型介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在增殖期它們極化為M2表型促進(jìn)傷口修復(fù)［4］。在糖尿病傷口愈合期間，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)從M1型向M2型的轉(zhuǎn)換障礙，繼而引起傷口內(nèi)持續(xù)的炎癥反應(yīng)及修復(fù)遲滯［3-4］。

膜聯(lián)蛋白超家族在結(jié)構(gòu)上均具有保守的中心結(jié)構(gòu)域和承擔(dān)獨(dú)特功能的N端結(jié)構(gòu)域，膜聯(lián)蛋白A1（annexin A1，ANXA1）屬于該家族的一員，被體內(nèi)多種細(xì)胞表達(dá)，其與甲酰肽受體2（formyl peptide receptor 2，F(xiàn)PR2）結(jié)合可發(fā)揮抗炎、保護(hù)神經(jīng)元和促進(jìn)腸黏膜修復(fù)等作用［5-8］。ANXA1裂解后可產(chǎn)生N末端肽Ac2-26，Ac2-26具有ANXA1的類似功能［5-6］。我們的前期研究提示，對(duì)糖尿病小鼠傷口應(yīng)用Ac2-26可抑制傷口內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量，但其作用機(jī)制尚不清楚［9］。在本研究中，我們擬體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）并予以高糖刺激，在此基礎(chǔ)上探討Ac2-26對(duì)高糖刺激的小鼠巨噬細(xì)胞極化的影響及其機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)C57BL/6雄性小鼠36只，6～8周齡，20～25 g，購(gòu)自南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，許可證號(hào)為SCXK（蘇）2018-0008。DMEM培養(yǎng)液、D-葡萄糖和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Thermo Fisher；巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）購(gòu)自Merck；Ac2-26和FPR2拮抗劑WRW4購(gòu)自Tocris Bioscience；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑wortmannin購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-10和 轉(zhuǎn)化 生 長(zhǎng) 因 子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA試劑盒購(gòu)自R&D；抗F4/80抗體、抗ANXA1抗體、抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗 體 及 抗 甘 露 糖 受 體（mannose receptor）/CD206抗體購(gòu)自Abcam；抗PI3K及磷酸化PI3K（p-PI3K）抗體、抗蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）抗體和β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的Ⅱ抗購(gòu)自Biorbyt。

2 主要方法

2.1 小鼠BMDM的提取與培養(yǎng)處死小鼠后，將其放置在75%的乙醇中消毒3 min。然后分離出小鼠的股骨和脛骨，置入含75%乙醇的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)。在無(wú)菌環(huán)境下，使用預(yù)冷的PBS洗去骨表面的乙醇，并剔除骨周圍的軟組織，將股骨和脛骨分開，再將骨置入PBS中清洗3次。然后剪掉骨的兩端，用含2% FBS的PBS將骨髓沖出，離心、棄上清，用含M-CSF（10μg/L）、D-葡萄糖（5.5 mmol/L）、10% FBS及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸骨髓細(xì)胞，放入37℃、5% CO2環(huán)境的孵箱中培養(yǎng)，第3天和第5天更換新鮮的培養(yǎng)液，第7天收集貼壁的細(xì)胞。使用F4/80抗體檢測(cè)巨噬細(xì)胞純度，每次獲得的巨噬細(xì)胞純度均在90%以上［10-11］。

2.2 高糖刺激將BMDM接種，培養(yǎng)過夜讓其貼壁后換液，加入含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液［12］，分別在高糖刺激后的6、12和24 h收集細(xì)胞。另外，直接收集培養(yǎng)過夜的貼壁細(xì)胞作為高糖刺激0 h的細(xì)胞。

2.3 干預(yù)實(shí)驗(yàn)將BMDM接種、培養(yǎng)過夜讓其貼壁，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理：（1）對(duì)照（control）組：用含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；（2）高糖（high glucose，HG）組：用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；（3）高糖+Ac2-26（HG+Ac2-26）組：在含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液中加入Ac2-26（1μmol/L或5μmol/L）［13］；（4）高糖+Ac2-26+FPR2拮抗劑（WRW4）組：在含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液中加入WRW4（10μmol/L）［13］，孵育30 min后再加入Ac2-26（5μmol/L）；（5）高糖+Ac2-26+PI3K抑制劑（wortmannin）組：在含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液中加入Ac2-26（5μmol/L）和wortmannin（1μmol/L）［14-15］。各組在干預(yù)24 h后收集細(xì)胞及其培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.4 ELISA檢測(cè)將細(xì)胞培養(yǎng)液離心、取上清，使用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β1的含量。檢測(cè)步驟按照試劑盒制造商的說明書進(jìn)行。

2.5 Western blot檢測(cè)用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度、配平。在每個(gè)蛋白樣品中加入上樣緩沖液，金屬浴加熱5 min，使蛋白充分變性。將蛋白樣品上樣、電泳、轉(zhuǎn)至PVDF膜上，然后將膜轉(zhuǎn)移至5%脫脂牛奶中封閉2 h，再使用相應(yīng)的Ⅰ抗孵育過夜。TBST洗膜3次，HRP標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h。洗膜3次后，使用ECL試劑盒發(fā)光顯影。曝光成像后，用ImageJ軟件分析各顯影條帶。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同時(shí)間的高糖刺激對(duì)小鼠BMDM的iNOS、CD206及ANXA1表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與高糖刺激0 h相比，iNOS（M1型極化標(biāo)志物）的表達(dá)在高糖刺激12 h后開始顯著升高（P＜0.05），于刺激24 h后進(jìn)一步升高（P＜0.01）；高糖刺激24 h后也顯著下調(diào)了CD206（M2型極化標(biāo)志物）的表達(dá)（P＜0.05）；高糖刺激6、12和24 h沒有顯著影響小鼠BMDM的ANXA1表達(dá)，見圖1。后續(xù)的干預(yù)實(shí)驗(yàn)選取24 h為干預(yù)時(shí)點(diǎn)。

Figure 1.The time-dependent effects of high glucose（30 mmol/L）on the expression of iNOS，CD206，and ANXA1 in BMDM.A and D：the protein expression of iNOS，CD206，and ANXA1 in BMDM was detected by Western blot；B，C and E：the protein levels of iNOS，CD206，and ANXA1 were evaluated by normalizing againstβ-actin.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h group.圖1 不同時(shí)間的高糖刺激對(duì)iNOS，CD206及ANXA1表達(dá)的影響

2 Ac2-26對(duì)高糖環(huán)境下小鼠BMDM極化的干預(yù)效應(yīng)及WRW4對(duì)Ac2-26作用的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常糖濃度的對(duì)照組相比，高糖組的iNOS表達(dá)顯著增加（P＜0.01），CD206的表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與高糖組相比，Ac2-26（1μmol/L或5μmol/L）能夠顯著抑制iNOS的表 達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），促 進(jìn)CD206的表 達(dá)（P＜0.01）；與高糖+Ac2-26（5μmol/L）組相比，WRW4（10μmol/L）抑制了Ac2-26（5μmol/L）的干預(yù)效應(yīng)，顯著上調(diào)了iNOS的表達(dá)（P＜0.05），下調(diào)了CD206的表達(dá)（P＜0.01），見圖2。

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖組BMDM產(chǎn)生的TNF-α和IL-6顯著增多（P＜0.01），而IL-10的分泌顯著減少（P＜0.01）；與高糖組相比，Ac2-26（1μmol/L或5μmol/L）可以顯著下調(diào)TNF-α和IL-6的產(chǎn)生（P＜0.05，P＜0.01），Ac2-26（5μmol/L）可以顯著上調(diào)IL-10的產(chǎn)生（P＜0.01）；與高糖+Ac2-26（5μmol/L）組相比，WRW4（10μmol/L）顯著抑制了Ac2-26（5μmol/L）對(duì)TNF-α、IL-6和IL-10分泌的調(diào)節(jié)作用（P＜0.05，P＜0.01）；見圖3A～3C。TGF-β1的分泌在各干預(yù)組之間無(wú)顯著差異，見圖3D。

Figure 2.The effects of high glucose，Ac2-26，and WRW4 on the expression of iNOS and CD206 in BMDM.A：the protein expression of iNOS and CD206 in BMDM was detected by Western blot；B and C：the protein levels of iNOS and CD206 were evaluated by normalizing againstβ-actin.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs HG+Ac2-26 group.圖2 高糖、Ac2-26及WRW4對(duì)iNOS和CD206表達(dá)的影響

Figure 3.The effects of high glucose，Ac2-26，and WRW4 on the secretion of cytokines in BMDM.A to D：the concentrations of TNF-α，IL-6，IL-10，and TGF-β1 in the culture supernatants of BMDM were measured by ELISA，respectively.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs HG+Ac2-26 group.圖3 高糖、Ac2-26及WRW4對(duì)BMDM細(xì)胞因子分泌的影響

3 高糖、Ac2-26及WRW4對(duì)細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

為了探討高糖和Ac2-26影響巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制，我們檢測(cè)了PI3K/AKT信號(hào)通路在小鼠BMDM中的激活情況。檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖組PI3K和AKT的磷酸化相對(duì)水平顯著降低（P＜0.05）；與高糖組相比，Ac2-26（1μmol/L或5μmol/L）可以顯著 上 調(diào)PI3K和AKT的 磷 酸 化 水 平（P＜0.05，P＜0.01），促進(jìn)PI3K/AKT的激活；與高糖+Ac2-26（5μmol/L）組相比，WRW4（10μmol/L）抑制了Ac2-26（5μmol/L）的干預(yù)效應(yīng)，顯著下調(diào)了PI3K和AKT的磷酸化水平（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。

Figure 4.The effects of high glucose，Ac2-26，and WRW4 on PI3K/AKT signaling pathway in BMDM.A：Western blot analysis of PI3K，p-PI3K，AKT，and p-AKT in BMDM；B：relative level of p-PI3K/PI3K；C：relative level of p-Akt/Akt.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs HG+Ac2-26 group.圖4 高糖、Ac2-26及WRW4對(duì)細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

4 PI3K抑制劑對(duì)高糖環(huán)境下Ac2-26調(diào)節(jié)小鼠BMDM極化的影響

為了進(jìn)一步探討Ac2-26是否通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)高糖刺激的小鼠巨噬細(xì)胞極化，高糖刺激的小鼠BMDM被予以Ac2-26干預(yù)或Ac2-26+PI3K抑制劑（wortmannin）的干預(yù)，然后檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果顯示，與高糖+Ac2-26組相比，應(yīng)用PI3K抑制劑（wortmannin）顯著抑制了Ac2-26對(duì)BMDM極化標(biāo)志物表達(dá)的影響，上調(diào)了iNOS的 表達(dá)（P＜0.05），下 調(diào)了CD206的 表 達(dá)（P＜0.01），見圖5。

Figure 5.PI3K inhibitor（wortmannin）inhibited the effects of Ac2-26 on BMDM polarization in high glucose environment.A：the protein expression of iNOS and CD206 in BMDM was detected by Western blot；B and C：the protein levels of iNOS and CD206 were evaluated by normalizing againstβ-actin.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs HG+Ac2-26 group.圖5 PI3K抑制劑對(duì)高糖環(huán)境下Ac2-26調(diào)節(jié)小鼠BMDM極化的影響

討 論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，具有吞噬、殺菌、呈遞抗原、促炎、抗炎及促修復(fù)等多種功能。巨噬細(xì)胞的功能多樣性可能與其表型的可塑性有關(guān)，在不同微環(huán)境的刺激下，巨噬細(xì)胞可以向M1或M2表型極化［16-17］。M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)iNOS和促炎因子，參與促炎反應(yīng)及病菌清除；而M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD206及精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）等，可以分泌抗炎因子或生長(zhǎng)因子，抑制炎性反應(yīng)，促進(jìn)損傷修復(fù)［3-4，16-17］。

糖尿病伴有免疫反應(yīng)異常，可引起持續(xù)的炎癥損害，繼而促進(jìn)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展［18-22］。高血糖誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞向促炎的M1表型極化，可能與上述的病理生理進(jìn)程有關(guān)［21-23］。我們的前期研究提示，應(yīng)用Ac2-26可以抑制小鼠糖尿病傷口的炎癥反應(yīng)，并上調(diào)傷口內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)傷口愈合［9］。Ac2-26是分子量較小的多肽，合成的成本較低，明確其作用機(jī)制，再轉(zhuǎn)化于臨床治療，將有較好的開發(fā)利用前景。

本研究顯示，高糖刺激可以上調(diào)小鼠BMDM的iNOS表達(dá)及促炎因子（TNF-α和IL-6）產(chǎn)生，下調(diào)CD206表達(dá)和抗炎因子（IL-10）產(chǎn)生。使用Ac2-26對(duì)高糖刺激的小鼠BMDM進(jìn)行干預(yù)，可抑制高糖的促炎作用和iNOS表達(dá)，并上調(diào)BMDM的CD206表達(dá)和IL-10產(chǎn)生。本研究結(jié)果提示，高糖刺激可以誘導(dǎo)小鼠BMDM向促炎的M1型極化，而Ac2-26可以抑制高糖的刺激作用，促進(jìn)BMDM向抗炎的M2型極化。

TGF-β是一種促進(jìn)纖維性修復(fù)的生長(zhǎng)因子，在傷口愈合期間主要由巨噬細(xì)胞分泌，繼而介導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和肌成纖維細(xì)胞分化［4］。我們的前期研究顯示，應(yīng)用Ac2-26可以上調(diào)小鼠糖尿病傷口內(nèi)TGF-β的蛋白水平［9］。而本研究表明，高糖刺激和Ac2-26干預(yù)均未顯著影響小鼠BMDM分泌TGF-β1，提示Ac2-26不能直接調(diào)節(jié)TGF-β的產(chǎn)生。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Ac2-26可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡的中性粒細(xì)胞，此吞噬過程伴隨著TGF-β的釋放［24］。在小鼠糖尿病傷口愈合期間，Ac2-26是否可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬作用，繼而促進(jìn)TGF-β的分泌，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

PI3K/AKT是經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它的激活可抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，而抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可以促進(jìn)M1型極化［25-27］。本研究顯示，高糖刺激可減少PI3K/AKT在小鼠BMDM中的磷酸化水平，抑制PI3K/AKT的激活，而應(yīng)用Ac2-26可以促進(jìn)PI3K/AKT的激活。而且，PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑（wortmannin）抑制了Ac2-26對(duì)BMDM極化標(biāo)志物表達(dá)的影響。研究結(jié)果提示，Ac2-26可能通過PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)小鼠BMDM的極化。

FPR2是介導(dǎo)ANXA1抗炎作用的受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，被激活后可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［5-6，28］。而且，Ac2-26可通過激活FPR2調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化［13］。本研究顯示，使用FPR2拮抗劑（WRW4）抑制了Ac2-26的干預(yù)效應(yīng)，提示FPR2可能介導(dǎo)了Ac2-26對(duì)小鼠BMDM極化的調(diào)控。但是，小鼠BMDM本身也表達(dá)ANXA1，WRW4也有可能阻斷內(nèi)源性ANXA1和FPR2的結(jié)合。鑒于ANXA1和Ac2-26在功能上的相似性，WRW4的干預(yù)效果也可能部分來自于其對(duì)內(nèi)源性ANXA1作用的阻斷。此外，本研究顯示高糖刺激24 h未顯著影響小鼠BMDM的ANXA1蛋白表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，高糖刺激48 h可上調(diào)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ANXA1 mRNA的表達(dá)［29］，刺激72 h可下調(diào)人類成纖維細(xì)胞的ANXA1蛋白表達(dá)［30］。由此可見，不同類型的細(xì)胞受到不同時(shí)間的高糖刺激，可以對(duì)ANXA1的表達(dá)產(chǎn)生不同的影響。至于長(zhǎng)期高糖刺激對(duì)巨噬細(xì)胞ANXA1表達(dá)的影響、高糖環(huán)境下內(nèi)源性ANXA1在巨噬細(xì)胞極化中的作用，尚需研究闡明。

綜上所述，本研究提示Ac2-26可以抑制高糖誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞極化，并促進(jìn)小鼠BMDM向抗炎的M2型極化，F(xiàn)PR2/PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可能介導(dǎo)了Ac2-26對(duì)小鼠BMDM極化的調(diào)控。