朱彬，鄭彩虹，邊英麟，施海濱

（1杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310000）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球新增腫瘤病例達(dá)1 930萬例，腫瘤死亡人數(shù)近1 000萬例［1］。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一種常用的抗腫瘤藥物，被廣泛用于卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌等實(shí)體腫瘤的治療［2］。PTX是新型抗微管藥物，通過促進(jìn)微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩(wěn)定，抑制細(xì)胞有絲分裂，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，PTX不僅僅影響腫瘤細(xì)胞，也影響中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞［3］。神經(jīng)毒性是PTX劑量限制性毒性的主要因素之一［4］，臨床表現(xiàn)為持續(xù)數(shù)月至數(shù)年的肢體麻木、疼痛以及對(duì)機(jī)械或冷刺激的超敏反應(yīng)［5］，導(dǎo)致患者無法足量完成PTX治療。因神經(jīng)毒性誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制不明，目前尚無有效鎮(zhèn)痛治療方法［6］。

微生物廣泛定植于皮膚和黏膜，在胃腸道中微生物密度最大，其次是結(jié)腸部分［7］。研究顯示腸道菌群在內(nèi)分泌、免疫功能以及藥物代謝、吸收方面發(fā)揮作用［8］，腸道菌群可通過“腸-軸”影響神經(jīng)系統(tǒng)功能［9］，PTX治療可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)和腸道炎癥［10］。Shen等［11］研究顯示腸道菌群在奧沙利鉑神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，然而腸道菌群是否影響大鼠PTX模型的神經(jīng)病理性疼痛，仍需要進(jìn)一步研究。

因此，基于以上研究，本項(xiàng)工作擬通過構(gòu)建大鼠PTX神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型，通過使用廣譜抗生素及糞便移植技術(shù)干預(yù)各組動(dòng)物腸道菌群，觀察腸道菌群在大鼠PTX神經(jīng)病理痛模型中的作用，并探討可能的分子機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

42只雄性清潔級(jí)SD大鼠，6～8周齡，200～250 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在（22±1）℃，濕度保持在65%～70%，12 h明/暗光照周期，自由飲食。

2 主要試劑

PTX（HJ20171227，Italy）；組織細(xì)胞快速裂解液（RIPA）和PBS購自上海碧云天生物公司；Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體（66350-1-Ig）、p38抗體（14064-1-AP）和GAPDH抗體（14064-1-AP）購自Proteintech；p-p38抗體（bs-0636R）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抗體（bs-10562R）和p-JNK抗體（bs-4163R）購自Bioss；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）抗體（Ab184699）和p-ERK1/2抗體（Ab201015）購自Abcam；BCA蛋白定量試劑盒（PICPI23223）、大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA檢測(cè)試劑盒（#BMS630）和大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA檢測(cè)試劑盒（#ERA56RB）均購自Thermo Scientific；Tween-20（BYL40713）購自Amresco。

3 主要方法

3.1 PTX神經(jīng)病理性疼痛模型的建立及分組大鼠適應(yīng)環(huán)境1周，在實(shí)驗(yàn)開始前1天（D0）測(cè)大鼠的基礎(chǔ)痛閾值，挑選合格大鼠。使用隨機(jī)數(shù)字法將24只大鼠分為對(duì)照（control）組、PTX+生理鹽水組（PTX組）、PTX+抗生素（antibiotic，Abx）組和PTX+糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）組，每組6只。另18只大鼠隨機(jī)分為PTX+TLR4激動(dòng)劑LPSPG Ultrapure組、PTX+TLR4抑 制 劑TAK242組 和PTX+p38抑制劑SB203580組，每組6只。按照文獻(xiàn)［12］構(gòu)建PTX神經(jīng)病理性疼痛模型，PTX各組在實(shí)驗(yàn)開始D1、D3、D5、D7分別通過腹腔注射PTX 2 mg·kg-1·d-1（溶于2.5 mL生理鹽水），穿刺位置為下腹部，避免穿刺入膀胱及反復(fù)穿刺，以防感染和造成大鼠不適［13］。對(duì)照組于相同時(shí)點(diǎn)腹腔注射等體積生理鹽水。PTX+LPS-PG Ultrapure組、PTX+TAK242組和PTX+SB203580組均在造模第1天鞘內(nèi)單次注射激動(dòng)劑或抑制劑（參考既往研究［14］）。各組大鼠飲用水內(nèi)容：PTX+Abx組飲用水中添加1.0 g/L氨芐西林鈉、1.0 g/L甲硝唑、1.0 g/L硫酸新霉素和0.5 g/L萬古霉素，與40%無菌糖漿混合，2 d更換一次，持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)；對(duì)照組、PTX組和PTX+FMT組大鼠每天飲用蒸餾水。PTX+FMT組每天固定時(shí)間給予2 mL細(xì)菌懸液灌胃，持續(xù)7 d；于同一時(shí)點(diǎn)，對(duì)照組、PTX組、PTX+LPS-PG Ultrapure組、PTX+TAK242和PTX+SB203580組均給予等體積蒸餾水灌胃，PTX+Abx組給予等體積的抗生素混合液灌胃。

3.2 FMT［15］收集對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)前新鮮糞便顆粒，用無菌PBS（每毫升1個(gè)糞便顆粒）稀釋浸泡約15 min，搖勻后888×g、4℃離心5 min，再取懸浮液在7 104×g、4℃離心5 min后，在PBS中過濾兩次。最后的細(xì)菌懸浮液與相同體積的40%無菌糖漿混合。PTX+FMT組大鼠于造模開始，每天給予2 mL細(xì)菌懸液灌胃并持續(xù)7天。

3.3 機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的測(cè)定采用SLY-HFM手持式測(cè)痛儀測(cè)定。大鼠被放置于透明有機(jī)玻璃罩內(nèi)，其底為細(xì)的金屬網(wǎng)，網(wǎng)格大小能夠滿足測(cè)量的需要，將大鼠放置30 min后進(jìn)入安靜狀態(tài)后，用手持式測(cè)痛儀垂直由金屬網(wǎng)格刺入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的右側(cè)足底中部并逐漸加大刺激力度，待大鼠突然出現(xiàn)縮足反應(yīng)時(shí)，手持式測(cè)痛儀可以自動(dòng)記錄動(dòng)物在縮足瞬間的機(jī)械刺激力度，儀器會(huì)自動(dòng)記錄壓力讀數(shù)（單位：g），間隔5 min測(cè)1次，共連續(xù)測(cè)定5次，取平均值為此時(shí)間點(diǎn)大鼠的MWT，在實(shí)驗(yàn)的前1天和實(shí)驗(yàn)的第7、12、21天分別測(cè)定。

3.4 熱縮足潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）的測(cè)定采用PL-200熱刺痛儀測(cè)定。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在透明的有機(jī)玻璃箱中，待其自由活動(dòng)逐漸處于安靜狀態(tài)時(shí)，在實(shí)驗(yàn)箱底部緩慢移動(dòng)熱輻射光源對(duì)于大鼠足底中部，打開熱輻射光時(shí)儀器自動(dòng)記錄開始時(shí)間，光透過透明的有機(jī)玻璃板底部聚焦于大鼠足底中部皮膚，待大鼠出現(xiàn)抬腿回避動(dòng)作時(shí)，儀器可以自動(dòng)記錄時(shí)間（單位：s），即為大鼠的TWL。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中光照強(qiáng)度保持一致，為避免熱刺激時(shí)間過長(zhǎng)造成組織損傷，光照25 s時(shí)儀器會(huì)自動(dòng)切斷電源，連續(xù)測(cè)量3次，每次間隔5 min，取平均值為此時(shí)間點(diǎn)此只大鼠的TWL，在實(shí)驗(yàn)的前1日和實(shí)驗(yàn)的第7、12、21天分別測(cè)定。

3.4 Western blot在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取結(jié)腸組織，用RIPA溶解組織，RIPA中含有0.05 mol/L Tris（pH 7.4）、0.15 mol/L氯化鈉、1%脫氧膽酸鈉、1% Triton X-100、0.1%十二烷基硫酸鈉。在4℃下溶解30 min，然后在4℃下10 656×g離心15 min，上清液保存在-80℃冰箱直至使用。采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清液蛋白濃度。常規(guī)電泳分離，200 mA，90 min。用5%脫脂奶粉TBST浸泡PVDF膜室溫封閉條帶1 h，加相應(yīng)Ⅰ抗（均1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗脫3次，每次5 min，隨后浸泡在HRP標(biāo)記的Ⅱ抗，37℃孵育1 h，用TBST洗滌3次，每次5 min。ECL發(fā)光顯色。以GAPDH作為內(nèi)參照，放入成像系統(tǒng)（Tanon-5200）中進(jìn)行掃描，使用ImageJ軟件測(cè)定蛋白印跡強(qiáng)度。

3.5 16S rDNA分析實(shí)驗(yàn)結(jié)束收集各組大鼠糞便，利用16S rDNA進(jìn)行糞便微生物分析。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。設(shè)計(jì)合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega）進(jìn)行定量檢測(cè)。使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit試劑盒進(jìn)行Miseq文庫構(gòu)建以及測(cè)序，將MiSeq測(cè)序得到的PE reads進(jìn)行樣本拆分，并進(jìn)行質(zhì)控、過濾、拼接。使用序列降噪方法（DADA2/Deblur等）處理優(yōu)化數(shù)據(jù)，獲得ASV（Amplicon Sequence Variant）代表序列和豐度信息，進(jìn)行群落組成分析以及物種差異分析。

3.6 檢測(cè)SD大鼠血清中炎癥因子的水平利用SD大鼠血漿IL-1β和TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)SD大鼠血清中炎癥因子的水平，樣品均采用復(fù)孔檢測(cè)，減少操作誤差。所有操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；率的比較采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 行為學(xué)的比較

PTX造模前（D0）測(cè)各組大鼠后足MWT，結(jié)果顯示4組大鼠的MWT基礎(chǔ)閾值相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模前測(cè)各組大鼠后足TWL，結(jié)果顯示大鼠的TWL基礎(chǔ)值相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組比較，PTX組大鼠在造模后第7、12、21天后足MWT和TWL均顯著降低（P＜0.01），隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，PTX組MWT和TWL均呈下降趨勢(shì)，在造模第21天，達(dá)到最低點(diǎn)。PTX+FMT組較正常對(duì)照組大鼠MWT和TWL下降趨勢(shì)，在造模第12、21天，PTX+FMT組MWT和TWL均較PTX組高（P＜0.05）。PTX+Abx組大鼠飲用廣譜抗生素后，MWT和TWL在第7、12、21天均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但與PTX組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、2。

表1 紫杉醇處理后大鼠機(jī)械痛反射閾值比較Table 1.Comparision of mechanical withdrawal threshold in rats after paclitaxel（PTX）treatment（g.Mean±SD.n=6）

表2 紫杉醇處理后大鼠熱縮足潛伏期比較Table 2.Comparision of thermal withdrawal latency in rats after paclitaxel（PTX）treatment（s.Mean±SD.n=6）

2 腸道菌群差異的比較

使用16S rDNA基因測(cè)序技術(shù)測(cè)定各組大鼠腸道菌群的組成及豐度。PTX組、PTX+FMT組和PTX+Abx組的腸道菌群較對(duì)照組均發(fā)生改變。根據(jù)樣本間群落豐度的相似性進(jìn)行聚類，將結(jié)果呈現(xiàn)在以顏色梯度來表示群落物種組成的群落Heatmap圖上。使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色變化與相似程度來反映不同分組在各分類水平上群落組成的相似性和差異性，并根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，評(píng)估各組間物種豐度差異的顯著性水平，結(jié)果顯示各 組 間Muribaculaceae（P=0.001）、Romboutsia（P=0.003）、Turicibacter（P＜0.001）、Corynebacterium（P＜0.001）、Oscillospiraceae（P＜0.001）、UCG-005（P=0.04）、UCG-014（P=0.04）等菌屬均有顯著差異，見圖1。

3 大鼠TLR4和MAPKs家族蛋白的表達(dá)

Western blot顯示，與對(duì)照組比較，PTX組大鼠TLR4、p-p38、p-JNK及p-ERK1/2蛋白水平均顯著上調(diào)（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，PTX+Abx組TLR4、pp38、p-JNK和p-ERK1/2蛋白水平均顯著上調(diào)（P＜0.01）；PTX+FMT組TLR4、p-p38、p-JNK和p-ERK1/2蛋白水平與對(duì)照組比較無顯著差異（P＞0.05），見圖2。

4 PTX模型大鼠鞘內(nèi)注射TLR4激動(dòng)劑LPS-PG Ultrapure、TLR4抑 制 劑TAK242或p38抑 制 劑SB203580對(duì)大鼠行為學(xué)及炎癥因子表達(dá)的影響

PTX模型大鼠造模第1天（D1）鞘內(nèi)單次注射LPS-PG Ultrapure，D7時(shí)大鼠MWT和TWL較對(duì)照組均顯著下降（P＜0.01）；PTX模型大鼠D1鞘內(nèi)單次注射TAK242或SB203580，均可逆轉(zhuǎn)PTX大鼠MWT及TWL下降趨勢(shì)，兩組MWT和TWL均較PTX組顯著升高（P＜0.01），見表3，4。

表3 LPS-PG Ultrapure、TAK242或SB203580鞘內(nèi)注射后大鼠機(jī)械痛反射閾值比較Table 3.Mechanical withdrawal threshold in rats after intrathecal injection of LPS-PG Ultrapure，TAK242 or SB203580（g.Mean±SD.n=6）

SD大鼠血清ELISA結(jié)果顯示，PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型中血清炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均高于對(duì)照組（P＜0.01）；PTX組大鼠D1鞘內(nèi)注射LPS-PG Ultrapure后，大鼠血清中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平均顯著高于對(duì)照組和PTX組（P＜0.01）；PTX模 型 大 鼠 鞘 內(nèi) 給 予TAK242或SB203580，大鼠血清中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平較PTX組顯著下降（P＜0.01），但仍較對(duì)照組高（P＜0.01），見表5。

表5 紫杉醇大鼠模型鞘內(nèi)注射LPS-PG Ultrapure、TAK242、SB203580后大鼠血清ELISA指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 5.The ELISA results of serum inflammatory factors after intrathecal injection of LPS-PG Ultrapure，TAK242 and SB203580 in paclitaxel（PTX）model rats（ng/L.Mean±SD.n=6）

討 論

Figure 1.Differential profiles of gut microbiota among control，PTX group，PTX+Abx group and PTX+FMT group（n=6）.A：heatmap of different levels among the groups；B：species difference analysis among groups.圖1 各組腸道菌群群落組成差異圖

PTX是一線的抗腫瘤藥物，主要副作用是劑量依賴性的神經(jīng)病理性疼痛［16］。高劑量PTX可引起軸突退行性改變，低劑量可觸發(fā)過敏性疼痛，包括異位性疼痛和痛覺過敏［17］。腸道菌群與神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ò蕴弁矗┲g的關(guān)系越來越受到關(guān)注。腸道菌群是內(nèi)臟疼痛的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而最近的證據(jù)表明，腸道菌群在許多其他類型的慢性疼痛中也可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括炎癥性疼痛、頭痛和神經(jīng)病理性疼痛等［18-19］。

Figure 2.The protein levels of TLR4，p-p38，p-JNK and p-ERK1/2 detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.001 vs control group；#P＜0.05 vs PTX group.圖2 TLR4和MAPKs家族蛋白的表達(dá)

在本研究中，我們以腸道菌群為切入點(diǎn)，通過干擾PTX模型大鼠的腸道菌群，探討腸道微生物在PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛模型中的作用，驗(yàn)證通過改變腸道菌群是否可以減輕PTX引起的神經(jīng)病理性疼痛，并尋找可能的相關(guān)分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)通過建立PTX大鼠模型，分組給予廣譜抗生素或移植正常大鼠糞便菌群，改變大鼠的腸道菌群的相對(duì)豐度。本實(shí)驗(yàn)通過喂飼PTX模型大鼠廣譜抗生素，有效減少大鼠腸道內(nèi)菌群，可降低大鼠的機(jī)械痛閾值和熱縮足反射閾值，導(dǎo)致大鼠機(jī)械痛、熱痛痛覺過敏，促進(jìn)大鼠TLR4、p-p38、p-JNK及p-ERK1/2等信號(hào)蛋白的表達(dá)；而移植正常對(duì)照組大鼠糞便菌群的PTX模型大鼠，可減輕機(jī)械痛閾值和熱縮足反射閾值下降趨勢(shì)，緩解大鼠機(jī)械痛、熱痛痛覺過敏，并抑制大鼠TLR4、p-p38、p-JNK及p-ERK1/2等信號(hào)蛋白的表達(dá)。16S rDNA分析各組大鼠腸道菌群，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PTX治療可引起腸道菌群失調(diào)，與既往的研究結(jié)果一致［20］，各組大鼠腸道菌屬豐度存在顯著差異，其中Muribaculaceae［21］、Romboutsia［22］、Turicibacter［23］、瘤胃球菌UCG-005及UCG-014［24］與維持腸道上皮細(xì)胞功能的穩(wěn)定、抑制炎癥和減少上皮細(xì)胞的凋亡有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腸道菌群在PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中的重要作用，通過調(diào)整腸道菌群可改善PTX模型大鼠的神經(jīng)病理性疼痛。我們的研究為預(yù)防PTX化療引起的神經(jīng)病理性疼痛提供了參考資料。

表4 LPS-PG Ultrapure、TAK242或SB203580鞘內(nèi)注射后大鼠熱縮足潛伏期比較Table 4.Comparision of thermal withdrawal latency in rats after intrathecal injection of LPS-PG Ultrapure，TAK242 or SB203580（s.Mean±SD.n=6）

既往研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的TLR4在嚙齒類動(dòng)物神經(jīng)性疼痛模型的行為超敏反應(yīng)中發(fā)揮作用［14，25］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTX造模后可促進(jìn)結(jié)腸組織TLR4的激活和MAPKs家族相關(guān)蛋白的磷酸化，但移植對(duì)照組正常腸道糞便菌群后，可明顯抑制TLR4及MAPKs家族相關(guān)蛋白的磷酸化表達(dá)。結(jié)合既往研究［14］，本實(shí)驗(yàn)選擇給予PTX模型大鼠鞘內(nèi)注射TLR4抑制劑TAK242或p38抑制劑SB203580，結(jié)果顯示均可抑制TLR4和p-p38蛋白的表達(dá)，說明TLR4與p38可能存在信號(hào)表達(dá)的上下游關(guān)系。PTX模型大鼠鞘內(nèi)注射抑制劑還可減少炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平，并緩解大鼠的機(jī)械痛和熱痛覺過敏，阻止PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展，但不能逆轉(zhuǎn)大鼠行為學(xué)的改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TLR4-MAPKs信號(hào)通路可能參與PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展，是否還有其他信號(hào)通路參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，PTX治療可改變大鼠腸道菌群種屬及豐度，促進(jìn)炎癥因子的釋放，激活TLR4和MAPKs，促進(jìn)大鼠的機(jī)械痛和熱痛痛覺過敏。我們的研究結(jié)果表明腸道菌群參與PTX誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與發(fā)展，可能通過激活TLR4-MAPKs信號(hào)通路，但仍需要進(jìn)一步研究。