曾富康，張宇星，周德生，陳瑤，劉利娟，李中△

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

腦梗死是一種由腦血管供血障礙導(dǎo)致腦缺血、缺氧和相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損的常見(jiàn)疾病，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因［1-2］。治療急性腦梗死的原則是及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)的再灌注，但快速再灌注可加重腦功能損傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）［3］。由于腦組織缺血缺氧，血液再灌注導(dǎo)致自由基的快速形成，導(dǎo)致大量炎癥因子的釋放，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，最終激活凋亡基因，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。研究表明，在CIRI中，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路的過(guò)度激活會(huì)加劇炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡［4］，而胱天蛋白酶3（caspase-3）作為caspase家族中的一個(gè)重要成員，常在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，被廣泛用作凋亡的生物標(biāo)志物［5］。

晝夜節(jié)律是自然界從單個(gè)細(xì)胞到高等生物廣泛存在的生命表象，指生物體為了適應(yīng)地球上周而復(fù)始的變化，逐漸進(jìn)化而形成的機(jī)體固有的節(jié)律變化，而這種節(jié)律正是在復(fù)雜的生物鐘基因及鐘控基因精密的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下，產(chǎn)生節(jié)律震蕩，調(diào)節(jié)著機(jī)體穩(wěn)態(tài)，影響著體內(nèi)生理病理過(guò)程［6］。Bmal1（brain and muscle Arnt-like 1）作為生物鐘的核心基因之一，發(fā)揮重要的調(diào)控作用。國(guó)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bmal1高表達(dá)可顯著減小缺血再灌注小鼠的梗死體積，減輕腦腫脹，降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分，促進(jìn)神經(jīng)元存活，減少細(xì)胞凋亡［7］，但具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。

PC12細(xì)胞來(lái)源于大鼠腎上腺髓質(zhì)中的嗜鉻細(xì)胞瘤，并具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特性，常被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究［8］，因此，我們通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染建立了PC12細(xì)胞Bmal1基因沉默模型和陰性對(duì)照模型，并使用氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）誘 導(dǎo) 建 立CIRI的體外損傷模型，探討核心生物鐘基因Bmal1對(duì)腦缺血再灌注損傷后PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞株大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)（貨號(hào)：TCR9）。

1.2 試劑DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：WH0521E91）和DMEM無(wú)糖培養(yǎng)液（批號(hào)：WH0221E41）均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；強(qiáng)效RIPA裂解液（批號(hào)：2021JOAC1053+）和CCK-8試 劑 盒（批 號(hào)：2021J0GF1008）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)分別為N20036303和N21036304）均購(gòu)自武漢華美生物工程限公司；抗磷酸化JNK、caspase-3和β-actin抗體（批號(hào)分別為80024-1-RR、19677-1-AP和66009-1-Ig）均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgGⅡ抗（批號(hào)：SY0102）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；超純總RNA提取試劑盒（批號(hào)：20200813）購(gòu)自杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒（批號(hào)分別為0522011和05238502）購(gòu)自蘇州近岸科技有限公司；β-actin引物由北京擎科生物有限公司合成；慢病毒si-Bmal1（序列 為5"-CACACATGGTTCCACAGCCAGTGAA-3"）和si-NC（序列為5"-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3"）購(gòu)自上海漢恒生物科技（上海）有限公司。

1.3 儀器三氣培養(yǎng)箱和Heraeus Fresco 17型超速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific）；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）；Cytation 3型多功能酶標(biāo)儀（BioTek）；Axio Vert A1倒置顯微鏡（ZEISS）；ChemiDocTMXRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽和Mini Trans-Blot型轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad）；CytoFLEX AW39253流式細(xì)胞儀（Beckman）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將PC12細(xì)胞放入含有3～4 mL完全培養(yǎng)基（89%高糖DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素混合液）的25T培養(yǎng)瓶中，置于37 °C的三氣培養(yǎng)箱（95%O2和5%CO2）中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于隨后實(shí)驗(yàn)。

2.2 PC12細(xì)胞OGD/R處理用無(wú)糖DMEM替代培養(yǎng)基，然后在5%CO2和95%N2的條件下放置4 h，后再棄去無(wú)糖培養(yǎng)基加入高糖培養(yǎng)基并放入含5%CO2的培養(yǎng)箱復(fù)氧24 h建立OGD/R模型［9］。

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染及si-Bmal1穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立將PC12細(xì)胞作為懸浮液，接種于每孔（6～8）×104的6孔板中24～36 h。當(dāng)其密度達(dá)到40%～50%時(shí)，根據(jù)MOI=50分別加入合適體積含si-Bmal1和si-NC的慢病毒培養(yǎng)基，24 h后，更換一次培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染72 h后，通過(guò)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，建立si-Bmal1穩(wěn)轉(zhuǎn)株，未處理的PC12細(xì)胞作為空白對(duì)照組。采用Western blot和RTqPCR檢測(cè)si-Bmal1沉默效率。感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=病毒滴度（TU/mL）×病毒體積（mL）/細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。（1）將細(xì)胞分為Bmal1沉默組、陰性對(duì)照組及空白組，每組以每孔2×107/L接種于96孔板上。每組重復(fù)5個(gè)孔，放入三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72和96 h。每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃下孵育2 h，使用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度（A），根據(jù)時(shí)間和相應(yīng)的值繪制細(xì)胞活力曲線。（2）分組同前，將PC12細(xì)胞以每孔2×107/L接種于96孔板，每組重復(fù)5個(gè)孔。經(jīng)OGD/R處理后，每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃下孵育2 h，用酶標(biāo)儀讀取450 nm處A值，并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔）/（A對(duì)照孔-A空白孔）×100%。

2.5 Western blot法檢測(cè)JNK/caspase-3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量收集各組細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液、磷酸酶抑制劑，冰上裂解，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，配制成2 g/L的蛋白體系，蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛奶室溫封閉60 min，分別加入p-JNK（1∶5 000）、caspase-3（1∶2 000）和β-actin（1∶8 000）Ⅰ抗，4℃孵育過(guò)夜；加入山羊抗兔IgG抗體（1∶8 000），37℃孵育60 min；采用ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，并用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

2.6 RT-qPCR檢測(cè)Bmal1及JNK/caspase-3信號(hào)通路mRNA的表達(dá)水平按照超純總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，最后使用擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，58℃30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析65～95℃，每0.5℃1個(gè)循環(huán)檢測(cè)熒光信號(hào)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析，以β-actin為內(nèi)參照。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子水平采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-6的水平。使用酶標(biāo)儀讀取樣品在450 nm處的A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本內(nèi)炎癥因子的含量。

2.8 流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL染色法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率每組的PC12細(xì)胞以每孔5×108/L的速度接種在24孔板的載玻片上，用OGD/R處理進(jìn)行建模。（1）根據(jù)凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在熒光顯微鏡每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)視野，使用ImageJ 5.0軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)目和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算TUNEL陽(yáng)性率。TUNEL陽(yáng)性率（%）=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)目×10%。（2）收集各組PC12細(xì)胞，用PBS調(diào)節(jié)濃度至3×108/L，然后在1 mL細(xì)胞懸液中加入200μL Annexin V-APC染色液，再加入20μL碘化丙啶染色液并混合，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。凋亡指數(shù)（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)量/檢測(cè)到的細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.9 免疫熒光檢測(cè)關(guān)鍵蛋白JNK核內(nèi)表達(dá)情況將各組PC12細(xì)胞用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，0.5%Triton X-100通透15 min，5%BSA室溫封閉60 min，加入PBS稀釋的Ⅰ抗（JNK 1∶500），4℃孵育過(guò)夜，PBS清洗3次，后加入PBS稀釋的熒光兔Ⅱ抗（1∶500），37℃孵育1 h，PBS清洗后，加入DAPI進(jìn)行染色，最后抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及畫(huà)圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間比較若符合正態(tài)性與方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析，若不符合正態(tài)性時(shí)，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染驗(yàn)證

如圖1所示，在熒光顯微鏡下可觀察到si-Bmal1組及si-NC組PC12細(xì)胞中GFP發(fā)出的熒光，blank組則無(wú)熒光蛋白表達(dá)，表明轉(zhuǎn)染模型建立成功，確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率＞90%；如圖2所示，與si-NC組相比，si-Bmal1組PC12細(xì)胞中Bmal1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05）。

Figure 1.Results of fluorescence expression after lentiviral transfection of circadian clock gene Bmal1.圖1 生物鐘基因Bmal1慢病毒轉(zhuǎn)染熒光表達(dá)結(jié)果

Figure 2.Validation of transfection efficiency of circadian clock gene Bmal1 silencing.A：the protein expression of Bmal1 detected by Western blot；B：the mRNA expression of Bmal1 detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-NC group.圖2 生物鐘基因Bmal1沉默轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

2 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)PC12細(xì)胞活力及OGD/R后細(xì)胞活力的影響

如圖3所示，在48 h、72 h和96 h時(shí)，與si-NC組相比si-Bmal1組細(xì)胞活力下降（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-Bmal1組在OGD/R后細(xì)胞活力抑制程度顯著增加（P＜0.01），提示沉默生物鐘基因Bmal1基因可能會(huì)抑制細(xì)胞活力及加重OGD損傷。

Figure 3.Effects of circadian clock gene Bmal1 silencing on PC12 cell viability at different time points（A）and after OGD/R（B）.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs si-NC group.圖3 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)PC12細(xì)胞活力及OGD/R后細(xì)胞活力的影響

3 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)JNK/caspase-3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

如圖4所示，與blank組相比，OGD/R組p-JNK及cleaved caspase-3蛋白水平顯著上升（P＜0.01）；與si-NC組相比，si-Bmal1組p-JNK及cleaved caspase-3蛋白水平進(jìn)一步升高（P＜0.05或P＜0.01），提示沉默Bmal1基因會(huì)促進(jìn)JNK蛋白磷酸化和caspase-3蛋白活化。

Figure 4.Effects of circadian clock gene Bmal1 silencing on JNK/caspase-3 signaling pathway-related protein expression.Mean±SD.n=4.##P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs si-NC group.圖4 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)JNK/caspase-3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)JNK/caspase-3信號(hào)通路mRNA表達(dá)的影響

如圖5所示，和blank組相比，OGD/R組JNK及caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）；與si-NC組相比，si-Bmal1組JNK及caspase-3 mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高（P＜0.05），提示沉默Bmal1基因會(huì)促進(jìn)JNK及caspase-3的mRNA表達(dá)。

Figure 5.Effects of circadian clock gene Bmal1 silencing on mRNA expression of JNK（A）and caspase-3（B）.Mean±SD.n=4.##P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05 vs si-NC group.圖5 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)JNK和caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

5 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)細(xì)胞上清液中炎癥因子水平的影響

如圖6所示，與blank組相比，OGD/R組炎癥因子IL-6及TNF-α水平顯著上升（P＜0.01）；與si-NC組相比，si-Bmal1組IL-6及TNF-α水平進(jìn)一步升高（P＜0.01），提示沉默Bmal1基因會(huì)促進(jìn)細(xì)胞炎癥因子IL-6及TNF-α的分泌。

Figure 6.Effects of circadian clock gene Bmal1 silencing on the levels of inflammatory factors in the cell supernatant.A：IL-6；B：TNF-α.Mean±SD.n=4.##P＜0.01 vs blank group；**P＜0.01 vs si-NC group.圖6 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)細(xì)胞上清液中炎癥因子水平的影響

6 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)細(xì)胞凋亡水平的影響

如圖7所示，與blank組相比較，OGD/R組細(xì)胞凋亡指數(shù)及TUNEL陽(yáng)性率水平均顯著上升（P＜0.05或P＜0.01）；與si-NC組相比，si-Bmal1組細(xì)胞凋亡指數(shù)及TUNEL陽(yáng)性率則進(jìn)一步升高（P＜0.05或P＜0.01），提示沉默Bmal1基因會(huì)加重細(xì)胞凋亡。

7 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)JNK核內(nèi)表達(dá)的影響

如圖8所示，blank組細(xì)胞JNK蛋白于胞漿及細(xì)胞核中均有分布；經(jīng)OGD/R誘導(dǎo)刺激后，JNK蛋白在細(xì)胞核內(nèi)熒光表達(dá)強(qiáng)度顯著升高（P＜0.01）；si-Bmal1組JNK蛋白較si-NC組相比在細(xì)胞核中熒光表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步升高（P＜0.05），提示沉默Bmal1基因會(huì)促進(jìn)JNK蛋白的核內(nèi)表達(dá)。

討 論

CIRI是急性腦梗死中常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡是再灌注損傷重要發(fā)病機(jī)制，也是繼發(fā)性腦功能損傷的重要原因，再灌注損傷細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與一系列炎癥反應(yīng)和凋亡因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞死亡形式，它是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)外因素的激活，導(dǎo)致細(xì)胞本身自殺程序形成的病理生理過(guò)程。目前對(duì)于再灌注損傷所引發(fā)的細(xì)胞凋亡暫無(wú)特殊治療方式及藥物，因此減輕細(xì)胞凋亡或許能成為腦缺血再灌注損傷的重要干預(yù)手段。大量文獻(xiàn)表明，晝夜節(jié)律顯著影響腦梗死的易感性、損傷、恢復(fù)和治療反應(yīng)機(jī)制［10］。晝夜節(jié)律是在細(xì)胞水平上發(fā)生的一種內(nèi)源性振蕩，其周期約為24 h，通過(guò)生物鐘基因調(diào)節(jié)著細(xì)胞生長(zhǎng)代謝，如增殖和分化等，參與了哺乳動(dòng)物的各種病理生理過(guò)程的調(diào)節(jié)和維持［11］。Bmal1是生物鐘的核心基因之一。研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因敲除可促進(jìn)人原髓細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞增殖能力［12］；靶向敲除生物鐘核心基因Bmal1的小鼠不僅顯示出晝夜節(jié)律的完全喪失、嚴(yán)重地降低了壽命，還伴有各種早衰癥狀和認(rèn)知缺陷、提高腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［13］。Bmal1作為生物鐘基因負(fù)反饋回路的關(guān)鍵調(diào)控元件，調(diào)節(jié)著體內(nèi)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、凋亡和自噬等過(guò)程［14-16］。實(shí)驗(yàn)研究表明，晝夜節(jié)律的破壞會(huì)加劇腦缺血再灌注小鼠大腦中的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致缺血性中風(fēng)后梗死面積增加，可能與免疫反應(yīng)失調(diào)相關(guān)［17］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，核心鐘基因Bmal1可直接通過(guò)E-box與其啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)控制核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的mRNA表達(dá)以調(diào)節(jié)其活性，缺乏Bmal1的細(xì)胞中Nrf2活性顯著降低，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生增加［18］。國(guó)外研究證明，敲減Bmal1基因會(huì)抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的表達(dá)，從而加劇了缺氧/復(fù)氧（hypoxia and reoxygenation，H/R）刺激下人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2的線粒體損傷，增加細(xì)胞凋亡的程度［19］。以上文獻(xiàn)均說(shuō)明生物鐘Bmal1基因不僅作用于缺血再灌注損傷中的單一機(jī)制，而是多重影響著缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激及自噬等過(guò)程［20］，但Bmal1基因是如何調(diào)控細(xì)胞凋亡的途徑尚未確定。

Figure 7.Effect of circadian clock gene Bmal1 silencing on the level of apoptosis.A：flow cytometry；B：TUNEL staining.Mean±SD.n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs si-NC group.圖7 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)細(xì)胞凋亡水平的影響

Figure 8.Effect of circadian clock gene Bmal1 silencing on JNK protein expression.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05 vs si-NC group.圖8 沉默生物鐘基因Bmal1對(duì)JNK蛋白表達(dá)的影響

JNK是絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成員之一，也被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）。JNK通路調(diào)節(jié)多種生理病理過(guò)程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和凋亡等［21］，是已被證實(shí)在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要調(diào)控作用的信號(hào)通路之一，且在缺血再灌注損傷過(guò)程中存在過(guò)度激活現(xiàn)象，抑制JNK通路可保護(hù)神經(jīng)元免受損傷［22］。JNK在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有分布，受到刺激后，JNK在細(xì)胞核中迅速顯著積累，導(dǎo)致相應(yīng)基因的表達(dá)發(fā)生改變［23］。研究顯示，腦缺血再灌注的刺激首先激活JNK信號(hào)通路，被激活的JNK又可進(jìn)一步磷酸化其核底物及胞漿底物，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡。JNK激活后可通過(guò)2條途徑發(fā)揮作用：一是上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白和炎癥因子如Bax、FasL和TNF等的表達(dá)從而激活死亡受體凋亡通路，另一條途徑是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的活性參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，通過(guò)這2條途徑激活的caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切割核DNA修復(fù)酶，從而導(dǎo)致核DNA不可復(fù)性的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［24］。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞在OGD/R誘導(dǎo)后細(xì)胞活力顯著下降，JNK mRNA及p-JNK蛋白水平均上升，JNK蛋白核內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，下游蛋白caspase-3被激活mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)，炎癥因子TNF-α和IL-6水平升高，細(xì)胞凋亡數(shù)增加，提示OGD/R誘導(dǎo)會(huì)激活JNK通路，從而促進(jìn)炎癥因子的釋放及細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們猜測(cè)Bmal1基因是否能夠通過(guò)調(diào)控JNK信號(hào)通路來(lái)減少細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡損傷，因此我們通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染建立PC12細(xì)胞Bmal1基因沉默模型及陰性對(duì)照模型，采用OGD/R誘導(dǎo)建立CIRI體外模型。結(jié)果顯示，沉默生物鐘基因Bmal1表達(dá)可顯著抑制PC12細(xì)胞的活力，這與既往的研究結(jié)果相符，但Bmal基因調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制此次實(shí)驗(yàn)未能深入研究。我們還發(fā)現(xiàn)相較正常組及Bmal基因陰性對(duì)照組，Bmal1基因沉默會(huì)增強(qiáng)OGD/R對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用，增加炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們通過(guò)Western blot、RT-qPCR及免疫熒光等檢測(cè)手段發(fā)現(xiàn)Bmal1基因沉默組在OGD/R后相較模型組及Bmal1基因陰性對(duì)照組JNK信號(hào)通路及下游caspase-3其蛋白及基因的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，炎癥因子水平IL-6和TNFα進(jìn)一步增加，Bmal1基因沉默組免疫熒光JNK蛋白核內(nèi)的高表達(dá)情況亦佐證了Bmal1基因?qū)NK/caspase-3信號(hào)通路具有調(diào)控作用。我們證實(shí)沉默核心鐘基因Bmal1會(huì)促進(jìn)JNK/caspase-3信號(hào)通路過(guò)度激活從而加重腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡損傷?；蛟S生物鐘基因可以作為一種新的治療靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)生物鐘或它的重要組成部分來(lái)降低CIRI所引發(fā)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡損傷。