王潔，柴曉洋，李昱晨，陸克義

（1山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經內科，山西 太原 030001；2首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院，北京 101149；3山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院核醫(yī)學科，山西 太原 030001）

創(chuàng)傷后癲癇（post-traumatic epilepsy，PTE）是患者在創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）一周之后出現(xiàn)的癲癇發(fā)作［1］，其潛伏期由數周至數年不等。在TBI患者中PTE的發(fā)病率為1.9%～30%［2］。臨床上，基于一些評價標準，如格拉斯哥昏迷評分、顱骨損傷程度、神經影像檢查結果等，可將TBI分為輕度、中度及重度，輕型TBI占TBI的90%以上［3］。輕型TBI后發(fā)生PTE危害巨大，然而臨床研究發(fā)現(xiàn)，腦電圖［4］、腦磁圖［5］等均無法作為預測PTE發(fā)生的有效檢查手段，故尚不知如何預測及預防PTE的發(fā)生，明確輕型TBI后PET的發(fā)病機制對于早期預測并預防其發(fā)生顯得尤為重要。

目前認為，PTE是一種非刺激性、由腦組織功能缺損而誘發(fā)的癲癇發(fā)作形式。一些研究表明，TBI后引發(fā)的興奮性遞質釋放增多、神經細胞丟失［6］及血腦屏障破壞均可增加PTE發(fā)生的風險。這些證據提示在PTE潛伏期內發(fā)生的神經生物學改變是引起PTE的重要原因。

谷氨酸（glutamate，Glu）是中樞興奮性神經遞質，大腦皮質含量最高。Glu過多可引起活性氧過量生成和/或細胞內抗氧化防御系統(tǒng)受損，使腦細胞過度興奮、自由基產生增多，并進而導致腦細胞損傷，引起癲癇、癡呆等疾?。?］。Glu可通過誘導腦細胞線粒體釋放活性氧，進而導致細胞損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，通過調節(jié)神經元氧化應激損傷［8］、保護線粒體膜電位［9］，可以減弱Glu所介導的細胞毒性作用，發(fā)揮神經保護作用。

本研究制備輕型TBI后PTE模型，觀察在PTE潛伏期內，皮層組織谷氨酸、凋亡及自噬水平變化。探討PTE潛伏期內的病理生理改變，為研究PTE的發(fā)生機制提供依據。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物雄性SD大鼠，體重180～220 g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證編號為：SCXK（晉）2019-0004。大鼠在室溫（25℃）下進行12 h的光照/黑暗循環(huán)飼養(yǎng)，適時喂水、喂食。本研究獲得山西醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑兔抗大鼠微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、beclin-1和β-actin抗體（Cell Signaling Technology）；生物素標記的山羊抗兔IgG、生物素標記的馬抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標記的鏈親和素（北京中衫生物技術有限公司）；caspase ELISA試劑盒為Invitrogen產品；雷帕霉素（rapamycin，Rapa）為LC Laboratories產品；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 輕型TBI后PTE模型制備用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，將其置入Noble-Collip創(chuàng)傷儀中（直徑約30.5 cm），以每分鐘40轉，轉動5 min。創(chuàng)傷組大鼠隨鼓轉動，每轉1圈跌落1次，sham組大鼠固定于創(chuàng)傷儀內壁，只隨創(chuàng)傷儀轉動，不由高處跌落。觀察造模后大鼠飲食活動情況，觀察并記錄TBI后7～90 d內發(fā)生癇性發(fā)作大鼠的數量及其發(fā)作形式。對于發(fā)生癇性發(fā)作的大鼠通過腦電圖觀察并記錄其腦電波情況，確認發(fā)生癇性發(fā)作。TBI后4 d將4μL的100 mmol/L FeCl2水溶液注射至成年SD大鼠感覺運動皮層（硬膜下1.2 mm），注射速度為1μL/min。對照組注射生理鹽水。觀察并記錄TBI后7～90 d內發(fā)生癇性發(fā)作大鼠的數量及其發(fā)作形式。對于發(fā)生癇性發(fā)作的大鼠通過腦電圖觀察并記錄其腦電波情況，確認發(fā)生癇性發(fā)作。

2.2 癲癇記錄觀察并記錄大鼠創(chuàng)傷前（30 min）、后（7～90 d）大鼠的行為學變化。用數字攝像機持續(xù)監(jiān)測大鼠的行為。根據Racine［10］制定的分級標準判定癲癇發(fā)作：0級（無任何癲癇發(fā)作）、Ⅰ級（凝視發(fā)作）、Ⅱ級（出現(xiàn)規(guī)律性點頭、伴或不伴面部抽動）、Ⅲ級（一側前肢震顫）、Ⅳ級（站立、雙前肢震顫及持續(xù)性點頭）、Ⅴ級（前肢震顫加重，失去平衡跌倒而出現(xiàn)全身強直-陣攣性發(fā)作）和Ⅵ級（發(fā)作衰竭導致死亡）。PTE發(fā)生率=發(fā)生癇性發(fā)作的大鼠數/每組大鼠數×100%。

2.3 電極植入和視頻腦電圖記錄將發(fā)作癲癇的大鼠稱重，用水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉。將大鼠固定于立體定位儀上，用鑷子輕輕拉出舌頭，防止呼吸道阻塞，兩側對稱，調整齒桿-2.3 mm固定，使顱骨處于同一水平面。用單面刀片剃去頭部毛，用碘伏消毒頭部皮膚。依次切開皮膚、皮下組織及骨膜，鈍性分離骨膜以暴露顱骨。3%H2O2燒灼止血并消毒顱骨表面，清晰暴露前、后囟。用顱骨鉆鉆透顱骨，小心打2個孔。將兩個腦電記錄電極置于顱骨孔中，輕輕接觸皮層。使用牙科水泥覆蓋并固定電極在顱骨上，無線發(fā)射端置于肩背側?？p合皮膚，將動物放回鼠籠，置溫暖安靜處，直至清醒。用于記錄腦電信號。

2.4 Western blot將創(chuàng)傷后大鼠海馬組織在冰浴環(huán)境中用酶解緩沖液溶解，超聲勻漿后離心，SDSPAGE分離蛋白，將蛋白轉至PVDF膜上，經封閉、與Ⅰ抗孵育、與相應Ⅱ抗孵育后，檢測免疫印跡。配制化學發(fā)光液，通過全自動曝光儀顯像，用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內參照，得出目的蛋白相對表達量。

2.5 ELISA法取創(chuàng)傷后大鼠海馬組織50 mg組織置于培養(yǎng)皿中，手術剪剪碎，加入200μL預冷的裂解液工作液，冰上用玻璃勻漿器勻漿。將勻漿好的樣本轉移到1.5 mL的離心管中，冰浴放置5 min裂解，12 000 r/min在4°C下離心10～15 min，小心地吸取上清轉移至新的EP管中，并置于冰上待用。取少量樣本用Bradford法測定蛋白濃度，按照試劑盒流程測定caspase-3及caspase-9酶活性。

2.6 高效液相色譜將已經過濾并脫氣的流動相注入儲液罐；用流動相沖洗金屬過濾器，然后將過濾器浸入儲液罐的流動相中；依次啟動高效液相色譜儀：泵→檢測器→高效液相色譜軟件→設置軟件參數；啟動泵，運行5 min，結束后關閉所有排氣閥；以固定的速率（1 mL/min）運行流動相，走基線，直到基線平穩(wěn)；基線平穩(wěn)后，在軟件中設置樣品的運行參數；將固定體積的樣品溶液注入進樣閥，然后在軟件中啟動注入命令，進樣器中的樣品溶液就隨流動相進入色譜柱；通過軟件監(jiān)視各項讀數，當檢測器檢測到樣品所有峰值，停止運行并設置新的進樣。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較用兩樣本t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析，率的比較采用卡方檢驗或Fisher檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 TBI后大鼠PTE易患性增加

TBI后大鼠7～90 d內PTE的發(fā)生率為11.2%，與sham組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示PTE模型制備成功。

為觀察TBI之后大鼠對不良刺激的敏感性，在造模后第4天予大鼠皮層注射明顯低于致癇劑量的FeCl2，結果顯示TBI+FeCl2組73.2%大鼠出現(xiàn)復雜部分性發(fā)作，同期sham+FeCl2組無1例大鼠出現(xiàn)癇性發(fā)作，TBI+FeCl2組與TBI組及sham+FeCl2組相比均有顯著差異（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.Incidence of post-traumatic epilepsy（PTE）of the rats in sham，TBI，TBI+FeCl2，sham+FeCl2 and zVAD+TBI+FeCl2 groups.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs TBI group；△△P＜0.01 vs TBI+FeCl2 group.圖1 各組大鼠PTE的發(fā)生率

2 神經細胞凋亡是TBI后PTE易患性增加的可能原因之一

TBI后給予FeCl2檢測到大鼠海馬神經細胞凋亡明顯增多，caspase-3及caspase-9活性升高，與sham+FeCl2組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

為觀察凋亡對PTE的影響，預先給予凋亡抑制劑zVAD-FMK（zVAD），結果顯示zVAD+TBI+FeCl2組PTE發(fā)生率下降至32.6%，與TBI+FeCl2組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

Figure 2.The activity of caspase-3 and caspase-9 in sham，TBI，sham+FeCl2，TBI+FeCl2，riluzole+TBI+FeCl2 groups.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs sham+FeCl2 group；△△P＜0.01 vs TBI+FeCl2 group.圖2 各組大鼠caspase-3和caspase-9活性

3 PTE潛伏期內腦組織中Glu生成增多可引起神經細胞凋亡水平升高

與sham+FeCl2組相比，TBI+FeCl2組 腦 內Glu含量顯著增多（P＜0.01），見圖3。為進一步明確Glu升高對凋亡的影響，預先給予Glu釋放抑制劑riluzole，結果顯示caspase-3和caspase-9活性均顯著降低（P＜0.01），見圖2。

4 PTE潛伏期內穩(wěn)定線粒體膜及清除自由基可抑制神經細胞凋亡

與TBI+FeCl2組相比，預先給予線粒體膜穩(wěn)定劑cyclosporine A可 顯 著 降 低caspase-3和caspase-9活性（P＜0.01），而給予自由基清除劑SOD后，caspase-9和caspase-3活性亦顯著下降（P＜0.05），見圖4。

5 TBI后自噬水平下降可導致神經細胞凋亡增多

與sham+FeCl2組相比，TBI+FeCl2組大腦皮層組織的LC3-II及beclin-1蛋白水平均顯著下降（P＜0.01）；預先給予自噬激動劑Rapa后，自噬水平升高，引起caspase-3水平下降，與TBI+FeCl2組相比有顯著差異（P＜0.01），見圖5。這提示上調自噬可減輕神經細胞凋亡。

Figure 3.Glutamate（Glu）content in rat brain tissues in sham，TBI，sham+FeCl2，and TBI+FeCl2 groups.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；##P＜0.01 vs sham+FeCl2 group.圖3 各組大鼠腦內Glu含量

Figure 4.Effects of stabilizing mitochondrial membrane and scavenging free radicals on the apoptosis in TBI，TBI+FeCl2，Cyclo+TBI+FeCl2 and SOD+TBI+FeCl2 groups.Mean±SD.n=6.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs TBI+FeCl2 group.圖4 穩(wěn)定線粒體膜及清除自由基對凋亡的影響

Figure 5.The protein expression of autophagy-related molecules and apoptosis-related molecules.Mean±SD.n=6.##P＜0.01 vs sham+FeCl2 group；△△P＜0.01 vs TBI+FeCl2 group.圖5 各組細胞自噬和凋亡相關蛋白的表達情況

討 論

PTE是TBI后的遲發(fā)性并發(fā)癥之一，TBI可以是由單純腦創(chuàng)傷引起，也可以是全身機械性創(chuàng)傷的局部表現(xiàn)。在實際生活中，TBI往往是一些柔和的以及震蕩性的輕型TBI。輕型TBI通常被稱為運動相關損傷的腦震蕩［11］，輕型TBI的發(fā)病率是重度及中度腦損傷的10倍以上。在美國，每年有超過380萬人被診斷出患有外傷性腦損傷，其常見原因包括機動車事故、運動損傷和與工作相關的事故［12］。這部分患者在全身損傷過程中，頭顱及心臟并未出現(xiàn)直接的損傷，然而有研究報道，其PTE發(fā)生率［13］明顯升高。目前3種最常用于研究PTE的TBI動物模型是：外側液壓沖擊損傷、重量下降沖擊加速度損傷和受控的皮質損傷。這三種動物模型均需要精確的外科開顱手術，使大腦的結構完整性遭到破壞，均為局灶性損傷，且損傷程度較重。除此之外實行開顱術（或顱骨切除術），可能會對硬腦膜產生輕微損傷或手術期間導致出血，這種損傷本身就有引起癲癇發(fā)作的可能。本研究中，我們使用Noble-Collip鼓制輕型TBI后PET模型，該模型可較好的模擬臨床上柔和的以及震蕩性的損傷過程。本研究發(fā)現(xiàn)，輕型TBI后大鼠7～90 d內PTE的發(fā)生率為11.2%，與既往報道相似，提示模型制備成功。

創(chuàng)傷后癲癇模型的局限性之一在于其PET發(fā)生率較低，尤其是輕型TBI后的PET，而非創(chuàng)傷后癲癇動物模型的癲癇發(fā)生率相對穩(wěn)定。嚴重創(chuàng)傷可以直接損傷腦細胞，導致皮層神經細胞異常放電，引起早發(fā)性癲癇，而輕度創(chuàng)傷可以通過使神經元細胞對損傷的敏感性增高，導致PTE易患性增加。皮層下注射FeCl2是制造創(chuàng)傷后癲癇的經典模型，通過模擬損傷后紅細胞外滲、溶解和含鐵血黃素沉積于神經纖維網內而導致癲癇發(fā)生，其致癇效果與劑量相關，小劑量不足以引起癲癇發(fā)作［14］。本研究在TBI后第4天予大鼠皮層下注射明顯低于致癇劑量的FeCl2，期間73.2%大鼠出現(xiàn)復雜部分性發(fā)作，而同期對照組中無1例大鼠出現(xiàn)癇性發(fā)作。結果表明，輕型TBI后PET對損傷的敏感性增加，提示其潛伏期內可能存在神經生物學改變，進而導致其對輕微損傷的敏感性增加。

細胞凋亡是一種由基因調控和一系列酶參與的細胞主動死亡過程，是一系列caspase級聯(lián)反應的結果［15］。caspase可通過多條途徑被活化，其中經線粒體途徑導致線粒體外膜通透化，釋放多種致凋亡因子引起caspase-9活化，最終激活凋亡效應酶即caspase-3，通過水解多種重要的蛋白而導致細胞凋亡。已有研究證實，神經保護劑可以通過減輕TBI后腦水腫及皮層細胞凋亡發(fā)揮腦保護作用［16］；通過降低caspase活性進而起到改善TBI后大鼠認知的作用［17］；通過減少TBI后繼發(fā)性神經元丟失促進神經功能恢復［18］，提示神經細胞凋亡在TBI后腦損傷過程中發(fā)揮了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與sham+FeCl2組相比，TBI后給予FeCl2檢測到大鼠腦內神經細胞凋亡明顯增多，caspase-3和caspase-9活性顯著升高。為進一步明確PTE易患性增加是否與神經細胞凋亡有關，我們在皮層注射小劑量FeCl2前，給予凋亡抑制劑zVAD-FMK后，caspase-3水平下降，且PTE的發(fā)生率明顯下降，提示神經細胞凋亡是TBI后PTE易患性增加的重要原因之一。在生理情況下，細胞凋亡受多種促凋亡分子和（或）抑制凋亡分子之間平衡的調控，而在病理狀況下，調控機制的失衡將導致疾病的發(fā)生。因此，闡明PTE潛伏期內促凋亡的機制，將成為預防PTE研究中非常有意義的關鍵環(huán)節(jié)。

Glu是中樞興奮性神經遞質，Glu過多可引起活性氧過量生成和/或細胞內抗氧化防御系統(tǒng)受損，使腦細胞過度興奮、自由基產生增多，并進而導致腦細胞損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，Glu可通過誘導腦細胞線粒體釋放活性氧，導致細胞損傷，而通過抑制一氧化氮合酶活性及減少一氧化氮的生成可以減弱Glu所介導的細胞毒性作用，發(fā)揮神經保護作用［8］。以上研究提示，腦內Glu產生增多可介導神經細胞損傷。在正常情況下，大多數位于線粒體內膜上的通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）處于關閉狀態(tài)，當機體在各種損傷因素作用下MPTP開放，線粒體膜電位下降，線粒體的通透性升高，細胞內活性氧等物質生成增多，促進細胞凋亡并導致相關器官的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與sham+FeCl2組相比，TBI+FeCl2組檢測到大鼠腦內Glu含量和神經細胞凋亡均明顯增多，以caspase-3及caspase-9的表達增高為主。而預先給予Glu抑制劑后，caspase-3及caspase-9表達下降，提示PTE潛伏期內Glu產生增多可能通過損傷線粒體導致神經細胞凋亡增多。

在進一步探討線粒體損傷在促進凋亡中的作用機制時，我們發(fā)現(xiàn)預先給予線粒體膜穩(wěn)定劑后，caspase-3及caspase-9明顯下降，而給予自由基清除劑后，雖然能夠降低caspase-9明顯，但只能輕度降低caspase-3，而這一現(xiàn)象無法用損傷線粒體釋放活性氧促凋亡的機制解釋，提示由Glu導致的線粒體損傷可能通過其他機制介導神經細胞凋亡。

正常情況下，受損傷的線粒體需要被及時清除以維持細胞的正?；顒訝顟B(tài)。研究表明，細胞主要通過自噬選擇性地清除損傷的線粒體［19］。自噬作為真核生物細胞內基本的新陳代謝活動之一，存在于神經元、膠質細胞和細胞外基質中，在其中發(fā)揮著的雙刃劍作用［20］，在生理狀況下，自噬能起到保護神經細胞的作用，而自噬的調節(jié)失常會引起神經退行性疾?。?1］及癲癇［22］。本研究中，我們檢測了PTE潛伏期內神經細胞的自噬水平，結果發(fā)現(xiàn)其水平明顯下降，而注射小劑量FeCl2之前預先給予自噬激動劑Rapa后，自噬水平升高，神經細胞凋亡明顯降低，提示自噬水平的降低是導致神經細胞凋亡的可能原因。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PTE潛伏期內Glu釋放增多，通過引起自噬水平下降進而導致神經細胞凋亡增加，可能是輕型TBI后PTE易患性增加的機制之一。