王燕鴿，趙昕，張蕾，古心雨，雷嬋豪，李瑞芳

（河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河南 洛陽 471023）

血管煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NADPH oxidase，NOX）激活引起的活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多在心肌肥大的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］，但是在心肌肥大發(fā)病中何種NOX亞型是有害的因素，何種NOX亞型是保護(hù)的因素尚不明確，NOX調(diào)控的下游信號通路還有待進(jìn)一步研究［2］。前期研究顯示腎性高血壓大鼠心臟中NOX4的表達(dá)隨著心肌肥大程度增加呈上升趨勢，并且隨著心肌肥大的發(fā)展組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）的表達(dá)也發(fā)生了變化，提示NOX4與HDAC均參與了高血壓左心室肥大的發(fā)病過程［3-4］。探討NOX4在心肌肥大中的調(diào)節(jié)模式，進(jìn)一步揭示NOX4對肥大信號的融合節(jié)點(diǎn)HDAC4和心肌肥大負(fù)性調(diào)控因子糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的調(diào)控機(jī)制，對研發(fā)心血管疾病的新靶點(diǎn)藥物具有重要價(jià)值。

材料和方法

1 動物

SPF級健康雌性SD大鼠，由河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SCXK（豫）2019-0002。實(shí)驗(yàn)使用2～3日齡新生SD乳大鼠，分離培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞。

2 主要試劑

內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）購自Sigma；NOX4抑制劑GKT137831購自Selleck；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce；RNase抑制劑購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol核酸提取試劑購自Invitrogen；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）購自上海碧云天技術(shù)有限公司；抗NOX4抗體、抗p-Akt抗體、抗p-GSK-3β抗體和抗p-HDAC4抗體（Abcam）；抗p47phox抗體和抗α-tubulin抗體（Proteintech）。實(shí)驗(yàn)引物由上海工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。

3 方法

3.1 原代心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)取2～3日齡的SD乳鼠進(jìn)行原代心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)。按照本實(shí)驗(yàn)室建立改良的心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法進(jìn)行［5］，乳鼠心肌組織用0.05 g/L DNase I和0.1%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液。差速貼壁分離后，加入含10%胎牛血清和0.1 mmol/L BrdU的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組將心肌細(xì)胞以每孔1×108/L的濃度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清和0.1 mmol/L BrdU的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞于24 h貼壁后，用無菌PBS沖洗2～3遍清洗死細(xì)胞，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液24 h，不同試劑對其進(jìn)行處理，并分為以下4組：（1）空白對照（control）組：以含10%血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；（2）GKT137831干預(yù)組：20μmol/L GKT137831處理24 h［6］；（3）ET-1造模組：0.1μmol/L ET-1處理24 h［5］；（4）GKT137831+ET-1干預(yù)組：20μmol/L GKT137831加0.1μmol/L ET-1處理24 h。

3.3 ROS檢測將1.5 h差速貼壁后的原代心肌細(xì)胞接種于6孔板中，37℃、5%CO2下的潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。心肌細(xì)胞24 h貼壁后分組處理，再于37℃、5% CO2下的潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。用無菌PBS沖洗2～3遍，然后加入DHE染色試劑，使終濃度為5μmol/L，并在37℃、5% CO2下遠(yuǎn)離光線的環(huán)境中一起孵育30 min。然后棄去培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞3次，熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

3.4 Western blot采用RIPA裂解液提取心肌細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，并將上樣量調(diào)整至50μg。通過10% SDS-PAGE分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗于4℃孵育過夜，與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光顯色法檢測蛋白條帶。用ImageJ軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

3.5 RT-qPCR采用Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA，用RNA純度分析儀檢測RNA濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，總反應(yīng)體積20μL：2×RT Mix 10μL，HiScript II Enzyme Mix 2μL，Oligo（dT）23VN（50μmol/L）1μL，random hexamers（50 mg/L）1μL，RNA 1μg。反應(yīng)條件為：25℃5 min，50℃15 min，85℃2 min。參照RT-qPCR試劑盒操作說明進(jìn)行RT-qPCR，總反應(yīng)體積20μL：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10.0μL，0.4μL 50×ROX Reference Dye 2，1μL DNA，0.4μL引物。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃1 min，95℃15 s，40個(gè)循環(huán)；60℃1 min，95℃15 s。然后，通過RT-qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析數(shù)據(jù)，分析所測基因的Ct值和特異性，以18S為內(nèi)參照，分析ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中肥大標(biāo)志物心房鈉尿因子（atrial natriuretic factor，ANF）和β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）的mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 7進(jìn)行柱狀圖繪制。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 抑制NOX4對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積及ANF和β-MHC mRNA表達(dá)的影響

心肌肥大的特征性表型變化包括心肌細(xì)胞表面積的增大，以及肥大標(biāo)志物ANF和β-MHC的表達(dá)。因此，我們觀察了GKT137831對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，ET-1刺激使心肌細(xì)胞表面積顯著增大；GKT137831處理可顯著減輕由ET-1引起的心肌細(xì)胞表面積的增加（P＜0.01），見圖1A。RT-qPCR檢測GKT137831對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANF和β-MHC表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，ET-1刺激顯著提高了心肌細(xì)胞中ANF和β-MHC的mRNA表達(dá)水平，而GKT137831處理則顯著抑制了ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中ANF和β-MHC的mRNA表達(dá)（P＜0.01），見圖1B。

2 抑制NOX4對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中ROS生成的影響

采用DHE染色法檢測GKT137831對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中ROS生成的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，ET-1刺激心肌細(xì)胞肥大后，顯著增加了心肌細(xì)胞中ROS的生成（P＜0.05），而GKT137831顯著減少了ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生（P＜0.01），見圖2。

3 抑制NOX4對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中NOX表達(dá)的影響

采用Western blot法 檢測GKT137831對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中NOX表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，經(jīng)過ET-1誘導(dǎo)后使肥大心肌細(xì)胞中NOX催化亞基NOX4和調(diào)節(jié)亞基p47phox的蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而GKT137831顯著抑制了ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中NOX4和p47phox的蛋白表達(dá)（P＜0.01），見圖3。

4 抑制NOX4對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中Akt/GSK-3β通路的影響

為了研究抑制NOX4對ET-1誘導(dǎo)的心肌肥大的潛在機(jī)制以及ET-1和GKT137831對Akt/GSK-3β通路的影響，我們采用Western blot法檢測GKT137831對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中磷酸化Akt/GSK-3β蛋白水平的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，經(jīng)過ET-1刺激后肥大心肌細(xì)胞中Akt和GSK-3β的磷酸化水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；而GKT137831處理顯著抑制了ET-1誘導(dǎo)的Akt和GSK-3β的磷酸化（P＜0.01），見圖4。

5 抑制NOX4對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中HDAC4磷酸化的影響

采用Western blot法 檢測GKT137831對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中HDAC4磷酸化水平的影響，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，由ET-1刺激的肥大心肌細(xì)胞經(jīng)過GKT137831處理后，GKT137831顯著降低了ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中HDAC4的磷酸化水平（P＜0.01），見圖5。

討 論

心力衰竭是多種心臟疾病的終末階段，是全球住院和死亡的主要原因之一，長期存在的心肌肥大可以導(dǎo)致心功能障礙和心力衰竭［7］。ET-1是一種血管收縮劑，可以刺激內(nèi)皮素系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，促進(jìn)心臟收縮，誘導(dǎo)心肌肥大［8］。在本研究中，通過在體外使用ET-1誘導(dǎo)的心肌肥大模型，我們檢測到NOX4是心肌肥大的正向調(diào)節(jié)因子，抑制NOX4可以防止ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中Akt/GSK-3β-HDAC4信號通路的激活，進(jìn)而防止和逆轉(zhuǎn)心肌肥大。

Figure 1.Effects of GKT137831 on the surface area（A）and the ANF andβ-MHC mRNA levels（B）in ET-1-induced cardiomyocytes.The scale bar=50μm.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs ET-1 group.圖1 GKT137831對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積及肥大標(biāo)志物ANF和β-MHC mRNA表達(dá)的影響

Figure 2.Effects of GKT137831 on ROS generation in ET-1-induced cardiomyocytes.The scale bar=100μm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs ET-1 group.圖2 GKT137831對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS生成的影響

Figure 3.Effects of GKT137831 on the protein expression of NOX4 and p47phox in ET-1-stimulated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs ET-1 group.圖3 GKT137831對ET-1刺激心肌細(xì)胞中NOX4和p47phox表達(dá)的影響

NOX的催化亞基在心血管細(xì)胞中包含多個(gè)亞型，它們在不同病理刺激因素作用下介導(dǎo)不同的病理過程，其作用機(jī)制尚不明確［9］。NOX4基因敲除可以顯著減輕動脈縮窄誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大，改善心臟功能，減少ROS生成［10］；但是，也有不同的報(bào)道顯示NOX4基因敲除小鼠在慢性壓力負(fù)荷誘導(dǎo)下可以出現(xiàn)嚴(yán)重的擴(kuò)張性心肌肥大和心臟收縮功能失調(diào)，而NOX4轉(zhuǎn)基因小鼠則受到保護(hù)［11］。研究者認(rèn)為這種矛盾的產(chǎn)生主要是由于基因敲除的程度和手術(shù)的方法不同，但這種解釋沒有足夠的說服力，關(guān)于NOX各亞型在不同病理發(fā)展過程中的作用尚需大量的實(shí)驗(yàn)來確證。因此，在本研究采用NOX4抑制劑GKT137831抑制肥大心肌細(xì)胞中NOX4的表達(dá)，結(jié)果觀察到其可以降低ET-1誘導(dǎo)的NOX4和p47phox的蛋白表達(dá)和ROS的生成，對ET-1刺激造成的氧化應(yīng)激和病理性心肌肥大有一定的治療作用，進(jìn)一步證明NOX4參與心肌肥大。

在小鼠心臟特異性過表達(dá)構(gòu)成性激活的GSK-3β，可以抑制動脈縮窄或異丙腎上腺素刺激誘導(dǎo)的心肌肥大，也可以部分防止激活的鈣調(diào)磷酸酶引起的心肌肥大反應(yīng)。ET-1和壓力超負(fù)荷都可能通過PI3K-Akt通路抑制GSK-3β，導(dǎo)致心肌肥大發(fā)生。這些研究表明GSK-3β在調(diào)節(jié)心肌肥大中起了至關(guān)重要的作用。GSK-3β可以磷酸化一系列的轉(zhuǎn)錄因子（NFAT、GATA4、c-Jun、c-Myc和cyclin D1），從而發(fā)揮抗心肌肥大作用［12］。在心肌肥大中NOX4是否通過調(diào)控GSK-3β，進(jìn)而影響與肥大相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，是研究中要解決的另一個(gè)問題。因此，本研究抑制肥大心肌細(xì)胞中NOX4的表達(dá)，結(jié)果顯示GKT137831減弱了ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增加、肥大標(biāo)志物ANF和β-MHC的mRNA表達(dá)以及Akt和GSK-3β的磷酸化，表明抑制NOX4減輕了ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，該作用與其抑制肥大信號通路Akt/GSK-3β的激活有關(guān)。

在心肌肥大十分復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)中，HDAC是一個(gè)重要的下游融合節(jié)點(diǎn)，調(diào)節(jié)許多與肥大相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，可能是治療心肌肥大的一個(gè)很有意義和前景的作用靶標(biāo)［13］。目前，國外關(guān)于HDAC的研究主要集中在抗腫瘤領(lǐng)域，已經(jīng)有一部分HDAC抑制劑開始用于臨床惡性腫瘤的治療［14］；而在心肌肥大發(fā)病中的研究，主要是通過基因敲除小鼠來闡明不同HDAC亞型的功能［15］。迄今為止，HDAC在高血壓心肌肥大中的作用及以其為靶標(biāo)的藥物治療，國內(nèi)外還未見報(bào)道。在本研究中，我們檢測了由ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中HDAC4蛋白的磷酸化水平，顯示GKT137831可以顯著降低HDAC4蛋白的磷酸化。因此，GKT137831抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌肥大反應(yīng)，該作用與HDAC4有關(guān)。NOX4可以影響ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中HDAC4的磷酸化水平。

Figure 4.Effects of GKT137831 on the phosphorylation of Akt and GSK-3βin ET-1-stimulated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs ET-1 group.圖4 GKT137831對ET-1刺激心肌細(xì)胞中Akt和GSK-3β磷酸化的影響

Figure 5.Effect of GKT137831 on the phosphorylaton of HDAC4 in ET-1-stimulated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs ET-1 group.圖5 GKT137831對ET-1刺激心肌細(xì)胞中HDAC4磷酸化的影響

綜上所述，本研究表明抑制NOX4顯著減輕了ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，減少了NOX的表達(dá)和ROS的生成，防止了Akt/GSK-3β-HDAC4信號通路的激活，部分逆轉(zhuǎn)心肌肥大。該研究為NOX4在心肌肥大發(fā)病中的調(diào)節(jié)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。