高詩娟，黃山，方光明，張燕紅，杜杰

（首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029）

急性心肌梗死是因冠狀動脈堵塞，導致急性、持續(xù)性缺血缺氧引起心肌細胞凋亡、壞死。組織損傷產(chǎn)生的內(nèi)源性信號分子通過激活Toll樣受體啟動炎性反應，招募中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤，清除梗死區(qū)域壞死細胞和細胞外基質(zhì)碎片。但持續(xù)存在的炎癥則加重心肌細胞丟失，加重收縮功能障礙、心室壁變薄，最終導致心臟破裂［1，2］。因此，減輕缺血缺氧誘導的心肌細胞凋亡、及時抑制梗死后炎癥，對于避免炎癥擴大加劇缺血心肌損害具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子Kruppel樣因子15（Kruppellike factor 15，KLF15）在多種心血管疾病中發(fā)揮保護作用，通過抑制促心肌肥大轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性發(fā)揮抗心肌肥厚的作用［3］，通過抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）介導的炎癥在動脈粥樣硬化中發(fā)揮保護作用［4］。但KLF15是否參與心肌梗死后細胞凋亡及炎癥的調(diào)控尚不清楚。本研究通過在KLF15基因敲除鼠中構(gòu)建急性心肌梗死模型，觀察KLF15對心肌梗死后心功能、心肌細胞凋亡及梗死后炎癥的作用。

材料和方法

1 動物

10～12周齡SPF級雄性C57BL6/J小鼠購自北京唯尚立德公司，以C57BL6/J為背景的KLF15基因敲除小鼠由本室構(gòu)建，飼養(yǎng)于北京安貞醫(yī)院SPF級動物房。所有動物實驗均遵守首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院實驗動物管理委員會的相關(guān)規(guī)定。

2 主要試劑

KLF15抗體購自Abcam；p65、p-p65及Bax抗體購自Cell Signaling Technology；麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）和α-actinin抗體購自Sigma；總RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和T-PER組 織蛋白 提取液購自Thermo Fisher Scientific；SYBR real-time PCR試劑購自TaKaRa；Masson染色液購自北京索萊寶科技有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自Promega；小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒購自BD Biosciences。

3 主要方法

3.1 小鼠心肌梗死模型構(gòu)建采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)建立小鼠心肌梗死模型［5-6］，具體如下：異氟烷麻醉小鼠后，仰臥位固定于鼠板，于第3、4肋間隙心臟部位做縱向約1.5 cm的切口，用3-0 proline絲線打一荷包松結(jié)備用。鈍性分離胸大肌肉與肋骨外肌肉，于第3～4肋間穿破肋間隙和心包膜，迅速擠出心臟，于左心耳下緣下約2 mm處以6～0 proline絲線結(jié)扎冠狀動脈，觀察到左心室前壁由鮮紅轉(zhuǎn)為暗紫至蒼白，快速把心臟推入胸腔，擠出胸內(nèi)氣體，系緊先前備用的荷包線，關(guān)胸。假手術(shù)組絲線僅穿過左冠狀動脈主干，不做結(jié)扎。

3.2 小動物超聲儀測定心功能心肌梗死術(shù)后28 d使用小動物超聲系統(tǒng)（Vevo 2100 High Resolution Imaging System）進行心臟超聲心動圖檢測。小鼠麻醉后仰臥位固定，保持心率在500～600 min-1時，采集胸骨旁長軸和心室中短軸圖像，記錄乳頭肌水平的M型軌跡。使用VisualSonics Vevo 2100軟件進行圖像分析。心功能評價指標包括左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短分數(shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）。

3.3 Masson膠原纖維染色收集心肌梗死術(shù)后28 d的野生及KLF15基因敲除小鼠心臟組織，10%中性甲醛固定后，石蠟包埋，制備4μm切片，脫蠟至水。使用Masson染色液染色，基本步驟如下：鐵蘇木素染色5～10 min，酸性乙醇分化5～15 s；Masson藍化液返藍3～5 min；麗春紅品紅染色5～10 min；磷鉬酸溶液洗1～2 min；苯胺藍染色1～2 min；乙醇脫水、中性樹膠封片。倒置電子顯微鏡（Nikon）采集圖像，膠原纖維呈藍色，心肌細胞呈紅色。采用NIS Br 3.0軟件計算纖維化面積。

3.4 WGA染色前述制備的心臟石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水后，抗原熱修復，羊血清工作液室溫封閉30 min，1∶100稀釋的WGA，37℃避光孵育1 h，PBS洗后，DAPI封片液封片。倒置熒光電子顯微鏡（Nikon）采集圖像，采用NIS Br 3.0軟件計算心肌纖維橫截面積，每張切片統(tǒng)計200個左右的肌纖維。

3.5 免疫組化收集假手術(shù)組及心肌梗死術(shù)后3 d的小鼠心臟組織，制備石蠟切片，脫蠟至水后，檸檬酸中抗原高壓熱修復，內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑處理20 min后PBS洗，血清室溫封閉30 min，加入KLF15抗體，4℃過夜，PBS洗后加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫30 min，PBS洗后DAB顯色；蘇木素復染3 min，自來水洗，鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水洗；脫水、透明、封片及鏡檢。使用Nikon ECLIPSE 90i顯微鏡采圖。

3.6 RNA提取及RT-qPCR分離野生小鼠心肌梗死術(shù)后0、1、3、7 d，以及野生與KLF15敲除小鼠心肌梗死術(shù)后3 d的心臟組織，使用TRIzol法提取總RNA。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：RNA與Oligo dT混合后，65℃孵育5 min，加入逆轉(zhuǎn)錄酶及緩沖液，42℃60 min反應，70℃5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。得到的cDNA使用SYBR試劑進行實時熒光定量PCR。GAPDH為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt法計算mRNA表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.7 Western blot檢測分離心肌梗死術(shù)后3 d的野生及KLF15基因敲除小鼠心臟，T-PER組織裂解液（補充0.5 mol/L EDTA、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒定量。將總量為80μg的蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入p-p65及p65抗體，4℃孵育過夜。加入Ⅱ抗室溫孵育2 h，使用Odyssey紅外熒光掃描成像儀捕獲目的條帶。

3.8 螢光素酶報告基因?qū)嶒灤笫笮募〖毎鸋9C2共轉(zhuǎn)染KLF15、NF-κB-Luc螢光素酶報告質(zhì)粒和pRL-TK海腎螢光素酶內(nèi)參照質(zhì)粒，并給予缺氧誘導（5% CO2，94% N2，1% O2）48 h后，收集細胞，用Promega雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測螢光素酶活性，結(jié)果通過多功能酶標儀讀取。

4 統(tǒng)計學處理

用GraphPad Prism 7.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。結(jié)果以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗；多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 心肌梗死早期KLF15表達下降

首先在Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫中分析了KLF15的組織及細胞表達（https：//www.proteinatlas.org/ENSG00000163884-KLF15/single+cell+type），結(jié)果顯示心臟組織中KLF15主要表達于心肌細胞（圖1A）。野生小鼠構(gòu)建心肌梗死模型，分別于術(shù)后0、1、3、7 d收集心臟組織，RT-qPCR檢測KLF15表達，結(jié)果顯示心肌梗死早期（術(shù)后1 d）KLF15的mRNA表達水平顯著下降（P＜0.05），見圖1B。免疫組化及Western Blot在心肌梗死術(shù)后3 d的心臟組織中均從蛋白水平證實了KLF15的表達降低（圖1C、D）。上述結(jié)果表明心肌梗死早期KLF15的表達下降。

2 KLF15基因缺失降低心肌梗死后小鼠存活率及心功能

野生小鼠18只及KLF15基因敲除小鼠17只行心肌梗死術(shù)，統(tǒng)計存活率：野生小鼠于術(shù)后第3天死亡3只，第4天死亡2只，第5天死亡1只，存活率為66.67%；KLF15基因敲除小鼠于術(shù)后第3天死亡5只，第4天死亡5只，第5天死亡1只，第7天死亡1只，存活率為29.40%。KLF15敲除小鼠心肌梗死術(shù)后存活率明顯低于野生小鼠（P＜0.05），見圖2A。術(shù)后28 d小動物超聲心動圖檢測心功能，結(jié)果顯示KLF15敲除小鼠LVEF及LVFS均低于野生小鼠（P＜0.01），見圖2B。這表明KLF15基因缺失加重心肌缺血損傷，導致心梗后存活率下降，心功能降低。

3 KLF15基因缺失加重心肌梗死后心臟重構(gòu)

心肌梗死術(shù)后28 d，收集野生及KLF15基因敲除小鼠心臟組織，觀察梗死后心臟重構(gòu)情況。首先用Masson染色比較兩組心臟梗死瘢痕面積。與對照鼠相比，KLF15基因敲除小鼠心臟梗死瘢痕面積增加（P＜0.01），見圖3A。WGA染色觀察非梗死區(qū)心肌細胞代償性肥大情況，結(jié)果顯示KLF15基因敲除小鼠的心肌細胞較野生小鼠明顯增大（P＜0.05），見圖3B。這些結(jié)果表明，KLF15基因敲除促進心肌梗死后心臟重構(gòu)。

Figure 1.Expression of KLF15 was down-regulated in hearts after myocardial infarction（MI）.A：single-cell RNA sequencing data set from Human Protein Atlas showed the normalized KLF15 mRNA levels in individual cells in hearts；B：KLF15 mRNA levels in infarcted mouse hearts at indicated time points after MI（n=5）；C：immunohistochemistry analysis of KLF15 protein levels in hearts at 3 d after MI（n=5；scale bar=20μm）；D：Western blot analysis of KLF15 protein levels in hearts at 3 d after MI（n=3）.Mean±SD.#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0 d；**P＜0.01 vs sham group.圖1 KLF15在心肌梗死后表達下降

4 心肌梗死中KLF15調(diào)控凋亡及炎癥因子表達

心肌梗死后缺血缺氧，誘導心肌細胞凋亡、壞死，并分泌炎癥因子，激活炎性信號，導致炎性損傷［2］。收集心肌梗死術(shù)后3 d野生及KLF15基因敲除小鼠結(jié)扎線下的心臟組織，RT-qPCR檢測凋亡相關(guān)蛋白（Bax和Bcl-2）及炎癥因子（IL-6和IL-1β）的mRNA表達。結(jié)果顯示，KLF15基因敲除小鼠心臟組織中促凋亡蛋白Bax的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），促炎因子IL-6及IL-1β的mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01），見圖4A。進而分別通過Western blot及ELISA檢測證實了KLF15基因敲除小鼠心臟組織中促凋亡蛋白Bax及促炎因子IL-6在蛋白水平表達升高，見圖4B、C。TUNEL凋亡染色結(jié)果顯示，KLF15基因敲除小鼠心臟組織中TUNEL陽性染色的細胞核比例顯著高于野生小鼠，見圖4D。上述結(jié)果表明，KLF15基因敲除促進心肌梗死后細胞凋亡，增加梗死后炎癥反應。

5 KLF15抑制缺氧誘導的NF-κB活化

Figure 2.KLF15 deficiency aggravated cardiac dysfunction after myocardial infarction（MI）.A：survival curves of wild-type（WT）mice（n=18）and KLF15 knock out（KO）mice（n=17）after MI；B：representative M-mode echocardiograms of WT and KLF15 KO mice at 28 d after MI were shown，and left ventricular ejection fraction（LVEF）and left ventricular fractional shortening（LVFS）were measured（n=5）.Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT.圖2 KLF15基因敲除加劇小鼠心肌梗死后心功能障礙

Figure 3.KLF15 deficiency aggravated cardiac remodeling after myocardial infarction（MI）.A：representative Masson staining of cardiac sections and quantification of infarct size in WT and KLF15 KO mice at 28 d after MI surgery（scale bar=500μm）；B：representative wheat germ agglutinin（WGA）staining of cardiac sections and quantification of cross-sectional cardiomyocyte area in WT and KLF15 KO mice at 28 d after MI surgery（scale bar=50μm）.Mean±SD.n=5.#P＜0.05，**P＜0.01 vs WT.圖3 KLF15基因敲除加重心肌梗死后心臟重構(gòu)程度

NF-κB是細胞缺氧后激活的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，參與炎癥、細胞凋亡等多種生物學過程的調(diào)控［7-8］。既往研究證實血管平滑肌細胞中KLF15抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制粥樣硬化中炎癥反應［4］。由此推測：KLF15在心肌梗死后對細胞凋亡及炎癥因子的表達調(diào)控可能與其對NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控有關(guān)。為此，我們在H9C2心肌細胞中轉(zhuǎn)染KLF15表達質(zhì)粒及NF-κB螢光素酶報告質(zhì)粒并在缺氧條件下培養(yǎng)48 h。螢光素酶活性檢測結(jié)果顯示，缺氧處理的細胞中NF-κB介導的螢光素酶活性顯著高于正常對照組（P＜0.01），而過表達KLF15則抑制缺氧誘導的NF-κB介導的螢光素酶表達（P＜0.01），表明KLF15抑制缺氧誘導的NF-κB活化，見圖5A。p65磷酸化是NF-κB活化的重要指標，收集心肌梗死術(shù)后3 d的心臟組織，Western blot比較野生及KLF15敲除小鼠心臟組織中p65的磷酸化水平。與野生小鼠相比，KLF15敲除小鼠心臟組織中磷酸化p65蛋白水平顯著升高，表明梗死的心臟組織中KLF15基因缺失增強NF-κB活化，見圖5B。上述體內(nèi)、外實驗證實KLF15抑制缺氧誘導的NF-κB活化。

Figure 4.Effect of KLF15 on the expression of apoptosis-related proteins and inflammatory cytokines in hearts after MI.A：the mRNA levels of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 and pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-1βin WT and KLF15 KO mouse hearts at 3 d after MI were assessed by RT-qPCR（n=5）；B：Western blot analysis of Bax protein level in hearts at 7 d after MI（n=3）；C：ELISA analysis of IL-6 protein level in hearts at 7 d after MI（n=5）；D：TUNEL staining（green）of hearts isolated from WT and KLF15 KO mice at day 0 and day 3 after MI（DAPI：blue，nuclei；α-actinin：red，cardiomyocytes；scale bar=50μ；n=5）.Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT；##P＜0.01 vs sham group.圖4 KLF15調(diào)控凋亡及炎癥因子表達

Figure 5.KLF15 inhibited hypoxia-induced NF-κB activation in vitro and in vivo.A：H9C2 cells transfected with pcDNA-KLF15，pNF-κB-Luc reporter plasmid and pRL-TK plasmid were cultured under hypoxia or normal condition for 48 h，and relative luciferase activity was analyzed；B：Western blot analysis of the phosphorylation of p65 in WT and KLF15 KO mouse hearts at 3 d after MI surgery.Mean±SD.n=3.△△P＜0.01 vs hypoxia；*P＜0.05 vs WT.圖5 KLF15抑制缺氧誘導的NF-κB活化

討 論

成年心肌幾乎不可再生，因此心肌梗死后的愈合依賴瘢痕修復。冠脈堵塞導致心肌細胞缺血、缺氧而凋亡、壞死。壞死的心肌釋放內(nèi)源性分子，以損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）激活固有免疫，招募巨噬細胞等炎性細胞浸潤，清除梗死區(qū)域壞死的細胞及細胞外基質(zhì)碎片。隨后肌成纖維細胞被激活，分泌大量細胞外基質(zhì)，替代梗死心肌，形成膠原纖維瘢痕［2］。然而形成的膠原纖維瘢痕缺乏有效的收縮功能，為了保證全身血液供應，非梗死區(qū)的心肌細胞代償性肥大。這種心肌梗死后心室形狀、室壁厚度以及心肌結(jié)構(gòu)等改變稱為心室重構(gòu)［9-10］。心室重構(gòu)是心肌梗死后慢性心力衰竭的主要病理基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)KLF15基因敲除鼠在心肌梗死后心功能明顯低于對照鼠，而梗死瘢痕面積及非梗死區(qū)心肌細胞代償性肥大程度均高于對照組，表明KLF15在心肌梗死后心臟重構(gòu)過程中發(fā)揮保護作用。

心肌梗死時，組織供氧減少，氧化應激，導致細胞膜通透性改變，啟動線粒體凋亡通路［11］。其中促凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2兩者共同參與調(diào)控心肌梗死后心肌細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)KLF15基因敲除小鼠在心肌梗死早期（3 d）心肌組織中促凋亡蛋白Bax表達明顯高于對照小鼠，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達低于對照小鼠，表明KLF15具有抑制心肌梗死后細胞凋亡的內(nèi)源性保護作用。

心肌梗死早期強烈而短暫的炎癥反應是清除梗死區(qū)域死亡細胞、激活肌成纖維細胞等修復細胞所必需的。但有效的損傷修復依賴于炎癥的及時消退。長期炎癥將加重心室重構(gòu)，最終導致心臟破裂等災難性結(jié)局［2］。多項臨床及基礎(chǔ)研究證實急性心肌梗死患者血清中TNF-α、IL-1β及IL-6等促炎因子顯著升高，并且血清IL-1β等炎癥因子水平與心肌梗死后死亡和再發(fā)生主要心血管事件風險獨立相關(guān)。而給予抗IL-1β或者IL-6抗體治療則顯著降低小鼠心肌梗死面積，改善心功能［12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)KLF15基因敲除鼠在心肌梗死早期（3 d）心臟中炎性因子IL-1β及IL-6的表達水平明顯高于對照鼠，表明KLF15具有抑制心肌梗死后炎癥反應的作用。

NF-κB是細胞在缺氧損傷后激活的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，參與炎癥、凋亡的調(diào)節(jié)［7］。NF-κB與心肌梗死后炎癥密切相關(guān)。壞死心肌釋放內(nèi)源性分子通過DAMP/TLR途徑激活NF-κB，活化的NF-κB入核，識別TNF-α、IL-1β及IL-6等炎性基因啟動子區(qū)的NFκB結(jié)合位點，并激活其表達。同時TNF-α及IL-1β等又促進NF-κB的活化，形成正反饋，導致持續(xù)的炎性反應［15］。此外，NF-κB與心肌梗死后心肌細胞凋亡也有關(guān)，心肌細胞凋亡過程中伴有NF-κB的活化［16］。因此，抑制心肌梗死后NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活具有抗炎、抗心室重構(gòu)的作用。本研究借助H9C2細胞中NF-κB介導的螢光素酶活性及梗死心肌中磷酸化p65水平檢測，發(fā)現(xiàn)KLF15抑制缺氧誘導的NF-κB轉(zhuǎn)錄激活。既往研究表明，動脈粥樣硬化模型中，血管平滑肌細胞KLF15通過與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300直接結(jié)合，抑制p300對NF-κB p65的乙酰化修飾，從而抑制p65的轉(zhuǎn)錄活性及下游靶基因單核細胞趨化因子1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）等的表達［4］。心肌梗死中KLF15通過何種機制抑制NFκB的活化尚有待探討。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示KLF15基因缺失導致NF-κB活化，促進心肌梗死后心肌細胞凋亡及炎癥損傷，增大梗死后瘢痕面積，降低心功能。這表明KLF15通過NF-κB信號通路在心肌梗死中發(fā)揮重要作用。