王雅麗，張寶鎖，張 雯，崔生玲，卿素珠，楊 奇*，張為民*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100，2.寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏銀川 7500011，3.寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司，寧夏吳忠 751600)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性條件致病桿菌，為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯氏菌屬(Klebsiella)成員，多存在于動(dòng)物黏膜表面或自然環(huán)境(如水、土壤等)中[1]，能夠引起動(dòng)物肺炎、腸炎、腦膜炎和敗血癥等嚴(yán)重疾病，也是一種重要的人獸共患病原菌。肺炎克雷伯菌具有多種質(zhì)粒和可移動(dòng)遺傳元件，基于此特點(diǎn)該菌可以攜帶多種抗性基因或從環(huán)境中獲得并積累抗性基因，或?qū)⒛退幓騻鬟f給敏感菌株，從而可能導(dǎo)致多重耐藥或者超級(jí)耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)[2-3]。肺炎克雷伯菌是引起醫(yī)院臨床感染的主要細(xì)菌之一[4]，2020年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示，肺炎克雷伯菌分離率在醫(yī)源革蘭氏陰性菌位居第二位，僅次于大腸埃希菌，且耐藥率也呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)[5]。

近年來(lái)，由于肺炎克雷伯菌對(duì)蛋雞的危害增大和耐藥性嚴(yán)重，常引起禽類(lèi)肺炎、眼炎、肝膿腫、腸炎、敗血癥和生殖系統(tǒng)疾病等?；诖?，本試驗(yàn)從蛋雞糞便中分離鑒定肺炎克雷伯菌，并對(duì)分離菌株的耐藥表型、耐藥基因和毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，以了解肺炎克雷伯菌的耐藥現(xiàn)狀和毒力基因流行情況，為動(dòng)物臨床用藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 選擇寧夏回族自治區(qū)某規(guī)?；半u場(chǎng)為采樣點(diǎn)，在雞舍內(nèi)隨即選取臨床健康雛雞(n=36)和產(chǎn)蛋雞(n=24)，用無(wú)菌棉簽蘸取其排泄的新鮮糞便(扒開(kāi)糞便表皮，蘸取內(nèi)部糞便)，置于無(wú)菌采樣袋，共60份。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸埃希菌(ATCC25922)和肺炎克雷伯菌(ATCC13883)由寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所提供。

1.1.3 主要試劑和儀器 麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂(MIAC)購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；VITEK 2革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡購(gòu)自生物梅里埃有限公司；革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏板(動(dòng)物源)購(gòu)自上海星佰生物技術(shù)公司；全自動(dòng)微生物鑒定儀(VITEK2)購(gòu)自梅里埃診斷產(chǎn)品有限公司；PCR儀購(gòu)自德國(guó)耶拿分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將糞便稀釋于蛋白胨緩沖液中增菌培養(yǎng)30 min，濾液添加至麥康凱肉湯孵育18～24 h。將菌液劃線接種于MIAC培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取培養(yǎng)基上單個(gè)、圓形、呈粉紅色至紫紅色且?guī)С恋憝h(huán)的菌落，再次劃線接種使其純化，直至平板上菌落形態(tài)一致且符合肺炎克雷伯菌菌落特征。每次傳代培養(yǎng)均設(shè)置肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13883為陽(yáng)性對(duì)照，未接種培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，并同條件培養(yǎng)。

1.2.2 PCR鑒定 采用煮沸法提取待測(cè)菌株模板DNA。參考文獻(xiàn)[6]合成肺炎克雷伯菌的特異性基因溶血酵素khe基因，上游引物5′-TGATTGCATTCGCCACTGG-3′，下游引物5′-GGTCAACCCAACGATCCTG-3′，目的基因片段大小為428 bp。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：2×DreamTaq Green Mix 8 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL和ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.25%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物系統(tǒng)鑒定 用無(wú)菌棉拭子挑取適量形態(tài)相似的菌落混懸于0.45%的無(wú)菌生理鹽水中，使其終濃度為0.5～0.63麥?zhǔn)蠞岫?。將菌液管和革蘭氏陰性鑒定卡放入卡架中，裝入梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)中自動(dòng)鑒定。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)CLSI相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作和結(jié)果判定。采用革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏板對(duì)分離株進(jìn)行14種常用抗菌藥物的敏感性檢測(cè)，包括氨芐西林(AMP)、奧格門(mén)丁(A/C)、慶大霉素(GEM)、大觀霉素(SPT)、四環(huán)素(TET)、氟苯尼考(FFC)、磺胺異噁唑(SF)、復(fù)方新諾明(甲氧卞定/磺胺甲惡唑，SXT)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢他啶(CAZ)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、美羅培南(MEM)和黏菌素(CL)。大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株。

1.2.5 耐藥基因和毒力基因檢測(cè) 依據(jù)參考文獻(xiàn)[7-16]設(shè)計(jì)耐藥基因和毒力基因引物，由西安擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。具體引物信息見(jiàn)表1和表2，包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaNDM、blaKPC、blaCTX和blaTEM，氨基糖苷類(lèi)aac(6')-Ib-cr、aadA1和rmtB、四環(huán)素類(lèi)tetA和tetB，喹諾酮類(lèi)qnrA、oqxA、oqxB、qnrB和gyrA以及粘菌素類(lèi)mcr-1，共15種耐藥基因。毒力基因包括莢膜多糖基因rmpA，脂多糖合成相關(guān)基因wabG和uge，鐵捕獲能力kfuBC和Aerobactin以及鐵載體entB和icuA。除退火溫度外，反應(yīng)體系與反應(yīng)程序同1.2.2。

表1 肺炎克雷伯菌耐藥基因序列

表2 肺炎克雷伯菌毒力基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 肺炎克雷伯菌株的菌落特征 肺炎克雷伯菌在MIAC培養(yǎng)基上形成邊緣光滑濕潤(rùn)、中間凸起的紫紅色菌落，菌落周?chē)谐恋憝h(huán)(圖1)。

圖1 肺炎克雷伯菌在MIAC培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.2 分離株P(guān)CR鑒定 肺炎克雷伯菌特異性基因khe的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為428 bp。以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13883為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)分離株進(jìn)行基因擴(kuò)增、核酸凝膠電泳鑒定，60份樣本中有48株菌株出現(xiàn)預(yù)期目的條帶，與標(biāo)準(zhǔn)菌株結(jié)果一致(圖2)。

圖2 部分菌株khe基因擴(kuò)增電泳鑒定結(jié)果

2.3 生化儀鑒定 VITEK2 Compact鑒定是在細(xì)菌生化反應(yīng)的基礎(chǔ)上，比對(duì)分析待檢細(xì)菌的生化反應(yīng)譜與對(duì)數(shù)期菌株的生物學(xué)特征來(lái)鑒定菌種。結(jié)果顯示，48株P(guān)CR陽(yáng)性的分離株均為肺炎克雷伯菌，可信度均在90.00%以上，分離率為80.00%(48/60)，其中雛雞糞便中肺炎克雷伯菌的分離率(36/36)高于產(chǎn)蛋雞(12/24)。

2.4 藥敏檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 分離菌株對(duì)14種抗菌藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果 藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示：質(zhì)控菌株藥敏結(jié)果在規(guī)定范圍內(nèi)，分離菌株對(duì)氨芐西林、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異噁唑和復(fù)方新諾明的耐藥率分別為100.00%、79.17%、81.25%、50.00%、72.91%和72.91%，呈現(xiàn)出高度抗藥性。對(duì)奧格門(mén)丁、慶大霉素、頭孢類(lèi)和喹諾酮類(lèi)藥物耐藥程度較低，耐藥率為14.58%～27.08%，未檢測(cè)出對(duì)美羅培南和黏菌素耐藥的菌株(表2)。

表3 肺炎克雷伯菌分離株對(duì)14種抗菌藥物藥敏檢測(cè)結(jié)果

2.4.2 雛雞和產(chǎn)蛋雞肺炎克雷伯菌分離株耐藥率統(tǒng)計(jì) 對(duì)雛雞和產(chǎn)蛋雞糞便分離到的肺炎克雷伯菌的藥敏結(jié)果進(jìn)行分析比較(圖3)。結(jié)果顯示各生長(zhǎng)階段分離菌株對(duì)氨芐西林均耐藥，對(duì)美羅培南和黏菌素均敏感，此外雛雞源分離菌株對(duì)大觀霉素、四環(huán)素、磺胺異噁唑和復(fù)方新諾明耐藥率均高于90.00%，且對(duì)其他11種抗菌藥的耐藥率均高于產(chǎn)蛋雞。

圖3 不同生長(zhǎng)階段肺炎克雷伯菌分離株耐藥率統(tǒng)計(jì)

2.4.3 分離菌株多重耐藥分析 對(duì)分離株的耐藥譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，12.50%菌株表現(xiàn)雙重耐藥，75.02%分離株表現(xiàn)為多重耐藥(≥3類(lèi)抗菌藥)，其中5重耐藥的菌株占比最高，為22.92%，最高為8重耐藥，占10.42%(圖4)。

圖4 肺炎克雷伯菌分離株多重耐藥率統(tǒng)計(jì)

2.5 耐藥基因和毒力基因檢測(cè) 48株肺炎克雷伯菌的耐藥基因和毒力基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4可知，共檢出6種耐藥基因，分別是blaTEM、aadA1、tetA、qnrB、oqxA和oqxB，以及uge、wabG、kfuBC和entB4種毒力基因，其他耐藥基因和毒力基因未檢出。

表4 肺炎克雷伯菌分離株耐藥基因和毒力基因檢出情況(%)

2.6 耐藥基因與耐藥表型比較分析 對(duì)48株肺炎克雷伯菌的耐藥表型和耐藥基因進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)表5。氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)耐藥表型陽(yáng)性率與aadA1和tetA基因的檢出情況基本符合，其耐藥表型高于基因型。在全部耐β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的分離菌株和1株中介程度的菌株中均檢測(cè)出了blaTEM基因。喹諾酮類(lèi)藥物方面，中介菌株qnrB基因陽(yáng)性率高于耐藥菌株，oqxA和oqxB基因在其耐藥、中介和敏感菌株中均有檢出。

表5 肺炎克雷伯菌耐藥表型與基因型的比對(duì)情況

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，從雛雞、奶牛、貂和犬等多種患病動(dòng)物均分離出高致病性、多重耐藥肺炎克雷伯菌[17-20]。本研究從60份健康蛋雞的糞便中分離到48株肺炎克雷伯菌，分離率為80.00%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)氨芐西林、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異噁唑和復(fù)方新諾明均表現(xiàn)出高度耐藥性，其中對(duì)氨芐西林屬于固有耐藥[21]，對(duì)奧格門(mén)丁、慶大霉素、頭孢類(lèi)和喹諾酮類(lèi)藥物耐藥程度較低，而對(duì)黏菌素和美羅培南敏感。多重耐藥情況較為嚴(yán)重，75.02%的分離菌株表現(xiàn)出多重耐藥性，其中以5重(22.92%)和7重耐藥菌(18.75%)為主，最高表現(xiàn)為8重耐藥菌(10.42%)。有研究表明，河南省雞源肺炎克雷伯菌(來(lái)自雞場(chǎng)環(huán)境、病死雞和市售雞肉)對(duì)環(huán)丙沙星(71.70%)和四環(huán)素(66.04%)表現(xiàn)出高度耐藥，49.06%的分離菌株表現(xiàn)為多重耐藥[19]，低于本研究分離菌株的耐藥水平；河北省乳房炎奶牛源分離到的肺炎克雷伯菌對(duì)慶大霉素和頭孢喹肟表現(xiàn)中度耐藥，耐藥率為48.90%和55.60%，高于本試驗(yàn)結(jié)果[18]，可見(jiàn)不同地區(qū)畜禽肺炎克雷伯菌耐藥性有差異，可能是臨床常用藥物存在差異導(dǎo)致。

本研究中雛雞源分離菌株對(duì)大觀霉素、四環(huán)素、磺胺異噁唑和復(fù)方新諾明耐藥率均高于90%，且對(duì)除氨芐西林、美羅培南和黏菌素外的11種抗菌藥物耐藥率均高于產(chǎn)蛋雞。需要注意的是，1株雛雞源肺炎克雷伯菌對(duì)12種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，以及2株產(chǎn)蛋雞源肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出多重耐藥性。對(duì)該蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)抗菌藥使用記錄調(diào)查發(fā)現(xiàn)，采集樣本的雞舍并未存在不規(guī)范或大量使用抗菌藥情況，且雞入舍以來(lái)僅使用過(guò)頭孢類(lèi)藥物，因此可能是養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)部環(huán)境消毒不徹底，存在細(xì)菌耐藥性的積累或蛋雛雞親代種群垂直傳播而導(dǎo)致的高度耐藥性。

肺炎克雷伯菌具有多種質(zhì)粒和可移動(dòng)的遺傳元件，是耐藥基因的主要傳播載體[3]。從48株肺炎克雷伯菌分離菌株中檢出6種耐藥基因，其中oqxA和oqxB檢出率最高，幾乎在所有分離菌中檢出，與陳強(qiáng)[22]研究一致。研究顯示，oqxA和oqxB參與編碼肺炎克雷伯菌外排泵，除介導(dǎo)喹諾酮類(lèi)耐藥外，還能夠降低菌株對(duì)替加環(huán)素和呋喃妥因的敏感性[23]。blaTEM基因的陽(yáng)性率與β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥表型相符率較高，而aadA1、tetA和qnrB在耐氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和喹諾酮類(lèi)的菌株檢出率較低，存在其他耐藥基因未檢出的可能性。

本研究對(duì)分離的雞源肺炎克雷伯菌莢膜、脂多糖和鐵源攝取系統(tǒng)共7種毒力基因進(jìn)行了檢測(cè)，其中entB、wabG、uge檢出率較高，kfuBC檢出率較低，而rmpA、Aerobactin和icuA基因未檢出。腸桿菌素生物合成鐵載體(entB)是一種由菌體細(xì)胞分泌的、能夠高度親和Fe3+的特異性鐵螯合劑，以幫助細(xì)菌攝取鐵源，在菌株毒力中起關(guān)鍵作用[24]，wabG基因能夠調(diào)控肺炎克雷伯菌脂多糖的合成，以及莢膜形成，幫助菌株躲避細(xì)胞的吞噬作用，并增強(qiáng)菌株的粘附能力[8,25]。uge基因參與肺炎克雷伯菌核心脂多糖的生物合成，人為構(gòu)建的uge基因突變體能夠顯著降低菌株的毒力和感染宿主的能力[26]。據(jù)報(bào)道，貢嘎等[27]從患呼吸道疾病的牦牛中分離到的8株肺炎克雷伯菌均攜帶mrkD、fimH和wabG；張傳美等[20]從患肺炎的水貂中分離的10株肺炎克雷伯菌，均攜帶uge、ureA、wabG和iucB基因，與本試驗(yàn)中uge和wabG毒力基因檢出率相似。

研究結(jié)果表明，雞場(chǎng)肺炎克雷伯菌分離率較高，且分離菌株對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物耐藥程度較為嚴(yán)重，可為該地區(qū)耐藥性監(jiān)測(cè)和疾病防控提供參考依據(jù)。