張 婷，程用斌，王舒婷，吳曉紅，凌 莉，李 嘉，李 禎，車彥卓，柏 旭

(陜西省農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，西安 710000)

可的松和氫化可的松屬于糖皮質(zhì)激素類[1]，是可隨動(dòng)物體應(yīng)激反應(yīng)而提升分泌水平的內(nèi)源性激素，不需要制定最大殘留量[2-4]，人工合成的可的松和氫化可的松屬于世界反興奮劑中心禁止運(yùn)動(dòng)員使用的藥物，規(guī)定其在動(dòng)物組織中的殘留限量均不得超過30 μg/kg[5]。

為了更合理、更科學(xué)地表示測(cè)量結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)相關(guān)認(rèn)可的技術(shù)規(guī)范要求進(jìn)行不確定度評(píng)價(jià)[6]，本文基于中心自建方法《動(dòng)物源性食品中克倫特羅等51種興奮劑的興奮劑檢測(cè)方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和CNAS-GL106《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[7]，在實(shí)踐過程發(fā)現(xiàn)51種興奮劑中可的松和氫化可的松的檢出率最高，故篩選出這兩項(xiàng)具有代表性的食源性興奮劑進(jìn)行研究，開展平行測(cè)試進(jìn)行不確定度分析，為檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性提供技術(shù)依據(jù)，同時(shí)為本實(shí)驗(yàn)室自建方法的建立提供數(shù)據(jù)支撐，為其他實(shí)驗(yàn)室采用內(nèi)標(biāo)法評(píng)定不確定度提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 TQ-S高效液相色譜-質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters儀器公司)；PL402-L型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；DU2A12FV超純水儀(澤布拉公司)；KQ-超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AutoEVA-20Plus全自動(dòng)氮吹濃縮儀(睿科儀器公司)。

1.2 試劑與材料 可的松標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(不確定度：2%，k=2；純度98.5%)(北京曼哈格生物科技有限公司)；氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(不確定度：3%，k=2；介質(zhì)：甲醇；濃度99.8ug/ml)(北京曼哈格生物科技有限公司)；氫化可的松-D3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(不確定度：5%，k=2；介質(zhì)：乙腈；濃度100 ug/mL)(阿爾塔科技有限公司)；甲醇(質(zhì)譜純，美國(guó)Thermo Fisher)；乙腈(色譜純，美國(guó)Thermo Fisher)；甲酸(美國(guó)Thermo Fisher)；無水硫酸鈉(分析純)。

除另有說明，試驗(yàn)中所用制劑均按GB/T 603的規(guī)定制備。水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 前處理方法 稱取試樣5.00 g(精確至±0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入100 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)中間液，渦旋混勻，加入10 mL1%甲酸乙腈，渦旋振蕩10 min，加入3 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩2 min，8000 r/min離心5 min，取上清液于另一干凈的50 mL具塞離心管中，剩余部分再用10 mL1%甲酸乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液，精密移取2 mL上清液于10 mL離心管中，于40 ℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL乙腈-水(50+50，v/v)溶液溶解殘?jiān)?，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相條件：A相：0.1%甲酸水，B相：0.1%甲酸甲醇；梯度洗脫：0～1 min，維持95%A；1～2 min，A相線性變化至80%；2～6 min，A相線性變化至40%；6～8 min，A相線性變化至20%；8～8.5 min，A相線性變化至10%；8.5～9.7 min，A相維持10%A；9.7～9.75 min，A相線性變化至0%；9.75～12.75 min，A相維持0%；12.75～12.8 min，A相線性變化至95%；12.8～15 min，A相維持95%。流速：0.35 mL/min，柱溫：40 ℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子化模式：電噴霧電離(ESI)；正離子模式；電離電壓：3200V；離子源溫度：150 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；干燥氣溫度：550 ℃；碰撞氣：氬氣。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜掃描參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取可的松對(duì)照品約10 mg，精密稱定。用甲醇溶解并定容至10 mL，配成濃度為1000.8 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后精密量取20 μL可的松標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、400 μL氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶，用甲醇分別配制成2.0、4.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。精密量取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成200 ng/mL可的松、400 ng/mL氫化可的松混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。同時(shí)精密量取1 mL氫化可的松-D3內(nèi)標(biāo)溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇配制成1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)溶液均置于-20 ℃保存。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取6份空白樣品，按照1.3.1前處理步驟得到空白殘余物，分別加入10 mL乙腈-水(50+50，v/v)溶解制成空白基質(zhì)溶液，分別精密量取0、100、200、300、400、800、1600 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于7個(gè)10 mL容量瓶中，各加入100 μL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，用空白基質(zhì)溶液定容至刻度，配成氫化可的松濃度分別為0、4、8、12、16、32、64 ng/mL；可的松濃度分別為0、2、4、6、8、16、32 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，過0.22 μm尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度數(shù)學(xué)模型建立

式中：X—試樣中各待測(cè)物的含量，μg/kg；C—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液待測(cè)組分的含量，ng/mL；Ci—測(cè)試液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，ng/mL；A—測(cè)試液中待測(cè)組分的峰面積；Asi—標(biāo)準(zhǔn)工作液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；V—定容體積，mL；Csi—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，ng/mL；Ai—測(cè)試液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；As—標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測(cè)組分的峰面積；m—樣品的稱樣量，g；f—稀釋倍數(shù)；R—方法回收率。

2.2 不確定度來源分析 根據(jù)檢測(cè)方法以及已建立的數(shù)學(xué)模型來分析，豬肉中可的松、氫化可的松的含量不確定度分量的主要來源為：Urel(1)樣品稱量引入的不確定度；Urel(2)樣品定容引入的不確定度；Urel(3)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度；Urel(4)回收率引入的不確定度；Urel(5)方法重復(fù)性引入的不確定度。具體來源分析如圖1。

圖1 不確定度來源

2.3 不確定度分量的評(píng)定

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度 (1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，按擴(kuò)展因子，k=2，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U(3.1)=u/(p×2)，見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度

(2)標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的相對(duì)不確定度

(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度

①標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)配液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

②標(biāo)準(zhǔn)中間液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

③標(biāo)準(zhǔn)使用液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

④加入內(nèi)標(biāo)引入的不確定度

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

⑤標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度

配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，使用A級(jí)0.1 mL分度吸量管8次，A級(jí)0.2 mL分度吸量管1次，A級(jí)1 mL分度吸量管3次，A級(jí)2 mL分度吸量管1次，A級(jí)10 mL容量瓶7次。標(biāo)準(zhǔn)曲線配制中體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表3。則此部分的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U(3.22)=

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程引入的不確定度

⑥標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度

本實(shí)驗(yàn)對(duì)可的松和氫化可的松混標(biāo)制備了7個(gè)不同濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度點(diǎn)檢測(cè)3次，工作曲線以外標(biāo)峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(A/Ai)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(Ci)為橫坐標(biāo)，采用最小二乘法擬合，使用權(quán)重1/x，得出目標(biāo)物的回歸方程為y=ax+b(其中a為斜率，b為截距)?？傻乃傻木€性方程為y=0.0851x+0.0042，氫化可的松線性方程為y=0.1544x+0.0248。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表5 豬肉中可的松和氫化可的松測(cè)定結(jié)果

Urel(3)=

氫化可的松由標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表6 豬肉中可的松和氫化可的松的回收率結(jié)果

2.3.6 不確定度的合成和結(jié)果表示 樣品的稱樣質(zhì)量、樣品定容、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、測(cè)量重復(fù)性與回收率等的不確定度分量相互獨(dú)立，將各不確定度進(jìn)行合成，即得相對(duì)合成不確定度Urel，按下式計(jì)算得到可的松：0.0646，氫化可的松：0.0616，所以可的松的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0646×3.386=0.2187，氫化可的松為0.0616×7.866=0.4845。具體結(jié)果見表7。

表7 不確定度分量評(píng)定表

2.3.7 擴(kuò)展不確定度 在置信水平為95%，取包含因子k=2，則可的松和氫化可的松的不確定度分別為U可的松=0.4374、U氫化可的松=0.9690，最終結(jié)果可表示為可的松含量X可的松=(3.386±0.4374)μg/kg，氫化可的松含量X氫化可的松=(7.866±0.9690)μg/kg。

3 結(jié) 論

本文分析過程中可知可的松和氫化可的松不確定度主要來源于樣品回收率、重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其稀釋過程中引入的不確定度，樣品回收率涉及到前處理和上機(jī)的過程，可能與儀器穩(wěn)定性以及提取過程中分取提取液人員操作有關(guān)系。因此，一是加強(qiáng)人員培訓(xùn)，嚴(yán)格規(guī)范操作，以減少人為因素引入的不確定度；二是平時(shí)加強(qiáng)儀器的維護(hù)保養(yǎng)，檢定校準(zhǔn)及期間核查，使儀器的各方面指標(biāo)都處于合理范圍之內(nèi)，減少由于儀器穩(wěn)定性造成的系統(tǒng)誤差；三是在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制以及前處理過程中，移取溶液時(shí)最好使用同一器具及準(zhǔn)確度較高的儀器設(shè)備，以減小測(cè)量的不確定度。