趙 卓，胡義彬，雷莉輝，武沛澤，武春霞，馬 巖，張巨峰，王 力，江厚生*

(1.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102600；2.北京華夏興洋生物科技有限公司，北京 102600；3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442)

牛病毒性腹瀉/黏膜病是由牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的傳染病，急性死亡病例剖檢以消化道黏膜發(fā)炎、糜爛和腸壁淋巴組織壞死為特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、流涎、腹瀉和消瘦，白細(xì)胞明顯減少。本病的感染率很高，但一般不表現(xiàn)臨床癥狀，發(fā)病率約5%，以6～18個(gè)月齡居多，病死率為90%～100%[1]。本病常年均可發(fā)生，感染動(dòng)物包括牛、羊、豬等，各種年齡的牛均易感，幼齡牛易感性最高[2]。

牛副流感是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type-3，BPIV3)引起的傳染病，是引起幼年和成年牛呼吸道疾病的重要病原。臨床感染牛的癥狀表現(xiàn)變化很大，從無癥狀感染到嚴(yán)重的呼吸道疾病。大部分感染BPIV3的牛僅表現(xiàn)咳嗽、發(fā)熱等癥狀，而存在應(yīng)激的牛則表現(xiàn)嚴(yán)重的組織損傷和免疫抑制，導(dǎo)致細(xì)菌繼發(fā)感染，表現(xiàn)為嚴(yán)重的肺部和胸腔出血性敗血癥，且常混合牛呼吸道其它病毒的感染，使病情加重。近幾年，在黑龍江、遼寧、新疆、云南、貴州、廣西、河北、山東、河南、江西、湖南、福建等地均有牛感染BPIV3的報(bào)道，表明該病已經(jīng)在我國部分省市呈現(xiàn)地區(qū)性流行，有調(diào)查研究結(jié)果顯示牛場總體陽性率為50%以上[3-4]。

牛傳染性鼻氣管炎是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起牛的一種急性接觸性傳染病，可感染不同物種，包括牛、山羊和綿羊[5]，以高熱、呼吸困難、鼻炎和上呼吸道炎癥為特征。該病在世界各地普遍存在，主要的經(jīng)濟(jì)損失在于延緩肥育牛的生長和增重，患病奶牛產(chǎn)乳量下降，繼發(fā)流產(chǎn)，其流產(chǎn)率有時(shí)高達(dá)50%，急性發(fā)病期牛死亡率可達(dá)10%。文獻(xiàn)報(bào)道我國大部分地區(qū)也存在該病的流行[6-7]。

控制本病的主要措施在于應(yīng)用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防接種。我國目前已有牛傳染性鼻氣管炎滅活疫苗和牛病毒性腹瀉/黏膜病(1型)疫苗上市銷售，但尚無牛病毒性腹瀉/黏膜病2型、牛副流感3型相關(guān)疫苗產(chǎn)品上市。本研究開展了牛病毒性腹瀉/黏膜病(1型+2型)、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感(3型)三聯(lián)滅活疫苗的實(shí)驗(yàn)室制備和免疫效力評(píng)價(jià)研究。

1 材 料

1.1 種毒 IBRV C1株，批號(hào)：2020002；BPIV3 HB01株，批號(hào)20200211；重組表達(dá)BVDV2 E2蛋白桿狀病毒，批號(hào)20200322，均由北京生泰爾科技股份有限公司提供。

1.2 細(xì)胞 MDBK細(xì)胞，液氮保存，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心；Sf9細(xì)胞和重組表達(dá)BVDV1 E2蛋白CHO細(xì)胞，由北京生泰爾科技股份有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 18～22 g小鼠10只，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；2～6月齡IBRV和BPIV3中和抗體≤1∶4、BVDV中和抗體≤1∶4、PCR檢測IBRV、BPIV3、BVDV陰性的健康犢牛50頭，購自河北省涿州市金瑞豐奶牛專業(yè)合作社。

1.4 試劑耗材 DMEM培養(yǎng)基，購自GBICO公司；CD CHO 011培養(yǎng)基，購自甘肅健順生物科技有限公司；IB905昆蟲細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)基，購自浙江壹生科生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，購自蘭州民海生物工程有限公司；Taq聚合酶，購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成；疫苗佐劑(605佐劑)，由北京生泰爾科技股份有限公司提供；微載體(cytodex1)，購自GE Healthcare公司；葡萄糖測定試劑盒，購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

1.5 儀器設(shè)備 攪拌式生物反應(yīng)器(5 L)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置生物顯微鏡，均由北京生泰爾科技股份有限公司提供。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1 MDBK細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 稱取20 g微載體，用PBS洗兩遍后，加入500 mL PBS，121 ℃高壓滅菌30 min。用前棄掉PBS，加入2 L DMEM培養(yǎng)基，進(jìn)行預(yù)熱。將消化好的細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)后，接種3×108數(shù)量級(jí)的細(xì)胞至盛有微載體的生物反應(yīng)器中，設(shè)定培養(yǎng)參數(shù)為轉(zhuǎn)速40～60 r/min，溫度37 ℃，pH值7.0～7.2，溶氧50%，氧氣、二氧化碳、氮?dú)夂涂諝饩O(shè)定0.2～0.6 MPa。每日取樣觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞殘?zhí)橇亢腿苎跚€進(jìn)行換液1～2次。

2.1.2 CHO細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 將細(xì)胞種子懸液轉(zhuǎn)移至搖瓶內(nèi)，加入適量CD CHO 011培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到7×106～8×106/mL時(shí)，采用生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)，起始密度控制在0.8×106～1.2×106/mL，控制pH為7.0左右，轉(zhuǎn)速100 r/min，培養(yǎng)22～24 h。

2.1.3 Sf9細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 將搖瓶培養(yǎng)生長良好的Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器，加入新的培養(yǎng)液，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105/mL。維持體系溶氧(DO)25%～35%，26～28 ℃培養(yǎng)22～24 h。

2.2 制苗抗原制備

2.2.1 IBRV和BPIV3培養(yǎng)和滅活 待MDBK細(xì)胞鋪滿整個(gè)載體表面時(shí)，靜置，棄去細(xì)胞生長液，加入適量的細(xì)胞維持液。將IBRV和BPIV3毒種用細(xì)胞維持液進(jìn)行1∶100稀釋后，再按細(xì)胞維持液加入量的1/100接種微載體懸浮培養(yǎng)的MDBK細(xì)胞，各項(xiàng)參數(shù)保持不變，培養(yǎng)72 h收獲。收獲的病毒培養(yǎng)產(chǎn)物凍融1～2次后，低速離心或過濾，除去微載體，收集培養(yǎng)液移至滅菌容器內(nèi)，置-15 ℃以下保存。取樣進(jìn)行病毒含量測定和無菌檢驗(yàn)，并將收獲的IBRV和BPIV3抗原采用終濃度為0.2%的甲醛進(jìn)行滅活。滅活完畢，分別取樣進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和滅活檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后用于疫苗配制。

2.2.2 BVDV1 E2蛋白制備和滅活 當(dāng)CHO細(xì)胞密度達(dá)到2×106～3×106/mL時(shí)進(jìn)行流加培養(yǎng)，調(diào)節(jié)pH為7.00±0.05，DO為40%，進(jìn)行蛋白的表達(dá)，在細(xì)胞活率降至50%時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，離心收取上清，采用親合樹脂進(jìn)行純化后，取樣進(jìn)行蛋白純度、濃度、瓊擴(kuò)效價(jià)檢測，并采用BEI進(jìn)行滅活。滅活完畢，取樣進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后用于疫苗配制。

2.2.3 BVDV2 E2蛋白制備和滅活 當(dāng)反應(yīng)器中的Sf9細(xì)胞密度達(dá)到2×106/mL，細(xì)胞活率不低于95%時(shí)，按1 MOI接種重組表達(dá)BVDV2 E2蛋白桿狀病毒。接毒后，維持體系溶氧(DO)25%～35%，26～28 ℃培養(yǎng)，逐日取樣觀察細(xì)胞病變，當(dāng)75%以上細(xì)胞病變時(shí)收獲。收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物在2～8 ℃條件下4000～1 0000 r/min離心，收取上清液采用親合樹脂進(jìn)行純化后，取樣進(jìn)行蛋白純度、濃度、瓊擴(kuò)效價(jià)檢測，并采用BEI進(jìn)行滅活。滅活完畢，取樣進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和滅活檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后用于疫苗配制。

2.3 半成品檢驗(yàn)

2.3.1 無菌檢驗(yàn) 將收獲的病毒液按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄[8]進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。

2.3.2 病毒含量測定 將收獲的IBRV和BPIV3病毒液用細(xì)胞維持液作10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種96孔板培養(yǎng)的MDBK單層細(xì)胞，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，每孔100 μL，置37 ℃、含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)觀察5 d，記錄特異性細(xì)胞病變，計(jì)算TCID50。IBRV病毒含量每毫升應(yīng)不低于108.0TCID50，BPIV3病毒含量每毫升應(yīng)不低于108.5TCID50。

2.3.3 蛋白效價(jià)測定 將收獲的BVDV1 E2蛋白抗原和BVDV2 E2蛋白抗原采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)法進(jìn)行效價(jià)檢測，效價(jià)應(yīng)不低于1∶32。

2.3.4 蛋白純度檢測 取BVDV1 E2蛋白抗原和BVDV2 E2蛋白抗原經(jīng)SDS凝膠電泳后進(jìn)行純度分析檢測，均應(yīng)不低于75%。

2.3.5 蛋白濃度測定 用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行測定，BVDV1 E2蛋白和BVDV2 E2蛋白濃度均應(yīng)不低于200 μg/mL。

2.3.6 滅活檢驗(yàn) 將滅活后的IBRV和BPIV3按細(xì)胞維持液的1/10量接種MDBK單層細(xì)胞2瓶，吸附1 h后棄去，補(bǔ)加維持液，37 ℃培養(yǎng)3 d。收獲病毒液凍融3次，再按細(xì)胞維持液的1/10量接種MDBK單層細(xì)胞2瓶，37 ℃培養(yǎng)3 d，以細(xì)胞不出現(xiàn)典型CPE判為合格。將BVDV2 E2蛋白加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)孔，置26～28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，用間接免疫熒光方法進(jìn)行檢測，以細(xì)胞不出現(xiàn)特異性綠色熒光判為合格。

2.4 疫苗制備和檢驗(yàn)

2.4.1 疫苗制備 將檢驗(yàn)合格的IBRV滅活液、BPIV3滅活液、BVDV1 E2蛋白、BVDV2 E2蛋白與605佐劑等比例混合，以100～300 r/min攪拌速度充分混合均勻。

2.4.2 疫苗常規(guī)檢驗(yàn) 按照現(xiàn)行《中國獸藥典》的方法分別進(jìn)行無菌、黏度、pH值、甲醛殘留檢測[8]。

2.4.3 疫苗安全性檢驗(yàn)

2.4.3.1 小鼠安全性檢驗(yàn) 背部皮下接種小鼠10只，每只0.3 mL，觀察14 d，記錄小白鼠的死亡情況及全身和局部的不良反應(yīng)。

2.4.3.2 靶動(dòng)物牛安全性檢驗(yàn) 肌肉接種健康易感牛5頭，每頭4.0 mL，觀察14 d，記錄局部和全身不良反應(yīng)。

2.4.4 疫苗效力檢驗(yàn)

2.4.4.1 抗體測定法 將疫苗肌肉接種健康易感牛5頭，每頭2.0 mL，免疫后21 d以相同方式和劑量加強(qiáng)免疫一次，二免后14 d采血，分離血清，分別進(jìn)行IBRV和BPIV3中和抗體以及BVDV1和BVDV2 E2蛋白瓊擴(kuò)抗體效價(jià)測定。

2.4.4.2 攻毒保護(hù)法 將疫苗肌肉接種健康易感牛20頭，每頭2.0 mL，免疫后21 d以相同方式和劑量加強(qiáng)免疫一次，二免后14 d，其中5頭免疫牛連同對(duì)照牛5頭，每頭接種IBRV C1株病毒10 mL(含108.3TCID50)；5頭免疫牛連同對(duì)照牛5頭，每頭接種BPIV3 HB01株病毒10 mL(含108.5TCID50)；5頭免疫牛連同對(duì)照牛5頭，每頭接種BVDV1強(qiáng)毒SD株(病毒含量為105.0TCID50/mL)4.0 mL；5頭免疫牛連同對(duì)照牛5頭，每頭接種BVDV2強(qiáng)毒XJ株(病毒含量為105.0TCID50/mL)4.0 mL。攻毒后連續(xù)觀察14 d，每日測定體溫，并于攻毒后第5～9天采集鼻拭子和肛門拭子進(jìn)行病原檢測，考察免疫牛排毒情況。以免疫牛不出現(xiàn)體溫升高、不出現(xiàn)臨床癥狀和不排毒作為免疫保護(hù)判定標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)免疫牛攻毒保護(hù)率。

3 結(jié) 果

3.1 制苗抗原的培養(yǎng)與檢驗(yàn) 將收獲的抗原分別進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、病毒含量測定、蛋白瓊擴(kuò)效價(jià)、純度、濃度以及滅活檢驗(yàn)，結(jié)果均符合三聯(lián)苗工藝規(guī)程和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，見表1。

表1 抗原制備各項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果

3.2 疫苗制備及檢驗(yàn) 將檢驗(yàn)合格的滅活抗原與605佐劑混合，制備成三聯(lián)滅活疫苗成品，并進(jìn)行各項(xiàng)檢驗(yàn)。結(jié)果顯示制備的疫苗外觀呈淡粉紅色透明液體，黏度為15.3 cP，甲醛殘留量為0.08%，pH值為7.2；10只小鼠經(jīng)安全性檢驗(yàn)均健活；采用靶動(dòng)物牛進(jìn)行安全性檢驗(yàn)，接種后未出現(xiàn)體溫升高、精神不振、食欲減退等全身不良反應(yīng)，接種后注射部位無紅腫和潰爛等局部不良反應(yīng)。

3.3 疫苗效力檢驗(yàn) 采用健康易感牛進(jìn)行疫苗接種后，分別進(jìn)行抗體測定和攻毒保護(hù)試驗(yàn)。免疫組IBRV和BPIV3中和抗體均可達(dá)到1∶77以上，BVDV1和BVDV2 E2蛋白瓊擴(kuò)抗體效價(jià)4/5以上牛達(dá)到1∶32以上，而對(duì)照組中和抗體均不超過1∶4，瓊擴(kuò)抗體效價(jià)均不超過1∶2；進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，免疫?？蛇_(dá)到4/5以上保護(hù)，對(duì)照牛4/5以上發(fā)病。具體試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 疫苗效力試驗(yàn)研究結(jié)果

4 結(jié)論與討論

目前，國內(nèi)已有牛傳染性鼻氣管炎滅活疫苗(C1株)、牛病毒性腹瀉/黏膜病滅活疫苗(1型，NM01株)、牛病毒性腹瀉/粘膜病、傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗(NMG株+LY株)等產(chǎn)品獲得國家《新獸藥注冊(cè)證書》，并上市銷售。國外已有四聯(lián)苗研究和上市的相關(guān)報(bào)道[9]。

本研究采用MDBK細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)IBRV和BPIV3，采用CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BVDV1 E2蛋白，采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BVDV2 E2蛋白，抗原經(jīng)純化和滅活后與新型水佐劑混合，成功制備出了牛病毒性腹瀉/黏膜病(1型+2型)、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感(3型)三聯(lián)滅活疫苗，且免疫效果良好。

面對(duì)國內(nèi)外生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，疫苗的類型也由傳統(tǒng)的全病毒苗、全菌苗向基因工程疫苗發(fā)展；細(xì)胞培養(yǎng)也由傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝向生物反應(yīng)器純懸浮培養(yǎng)工藝發(fā)展；疫苗佐劑也由傳統(tǒng)的礦物油佐劑、鋁膠佐劑向新型水佐劑發(fā)展。本研究采用這些新技術(shù)開展了實(shí)驗(yàn)室研究，獲得了理想的試驗(yàn)結(jié)果。