戴 青，陸連壽，趙富華，張秀英

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

乙酰氨基阿維菌素是乙酰氨基阿維菌素B1a和B1b兩個組分的混合物，主要組分為乙酰氨基阿維菌素B1a，是一種高效、廣譜、低殘留的獸用驅(qū)蟲藥物，是美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐盟批準的唯一應(yīng)用于泌乳奶牛無需棄奶的廣譜驅(qū)蟲藥[1-2]，臨床上主要用于防治畜類的虱、螨、蠅等各種內(nèi)外寄生蟲，目前制劑為乙酰氨基阿維菌素注射液和乙酰氨基阿維菌素澆潑劑。經(jīng)國家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫查詢，目前我國在有效期內(nèi)的乙酰氨基阿維菌素原料及制劑的獸藥批準文號有100多個?！吨袊F藥典》一部收載了乙酰氨基阿維菌素與乙酰氨基阿維菌素注射液[3]，質(zhì)量標準中均需用到乙酰氨基阿維菌素對照品來測定乙酰氨基阿維菌素(B1a+B1b)的含量。美國藥典委員會可供應(yīng)乙酰氨基阿維菌素USP對照品，但國外對照品價格昂貴，購買周期長，給國內(nèi)相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)和檢測機構(gòu)的質(zhì)量控制帶來不便。因此，擬研制乙酰氨基阿維菌素對照品，用于乙酰氨基阿維菌素及其制劑的鑒別與含量測定，對于獸藥生產(chǎn)企業(yè)乙酰氨基阿維菌素及制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。

本次研制分別采用質(zhì)量平衡法與高效液相色譜外標法兩種方法對乙酰氨基阿維菌素原料的含量進行定值研究。其中質(zhì)量平衡法以色譜純度、水分、殘留溶劑、熾灼殘渣等關(guān)鍵指標進行定值，高效液相色譜外標法以USP對照品作為溯源對照品進行定值，以確保含量賦值的準確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津2010A高效液相色譜儀；Waters Synapt HDMS質(zhì)譜儀；Agilent 7890A氣相色譜儀；Mettler Toledo XS205電子分析天平(精度0.01 mg)； Metrohm 701 KF Titrino卡氏水分測定儀；CWF 11/5高溫爐。

1.2 試藥 乙酰氨基阿維菌素原料由浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；乙酰氨基阿維菌素USP對照品批號1237752，含量95.1%(其中乙酰氨基阿維菌素B1a含量90.09%，B1b含量5.01%)；乙腈為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶解度 分別考察乙酰氨基阿維菌素原料在甲醇、乙醇、三氯甲烷、丙酮、水中的溶解度，測定結(jié)果(表1)與獸藥典中對乙酰氨基阿維菌素溶解度的規(guī)定一致。

表1 乙酰氨基阿維菌素原料的溶解度

2.2 引濕性 根據(jù)獸藥引濕性試驗指導(dǎo)原則，將原料在恒溫恒濕條件下(溫度25 ℃，相對濕度80%)放置24 h后計算增重百分率，判定樣品引濕性。結(jié)果測得樣品的增重百分率為8.7%，表明原料有引濕性。為進一步判定試驗條件下暴露時間對水分的影響，將原料在常規(guī)試驗條件下(溫度25 ℃，相對濕度40%)于天平室內(nèi)敞口放置10、20、30、40、50、60 min，分別計算增重百分率，結(jié)果見表2，10分鐘內(nèi)樣品增重百分率小于0.5%，隨著放置時間延長，逐漸吸濕增重，表明稱量時應(yīng)控制好稱量環(huán)境的濕度，快速稱樣。

表2 乙酰氨基阿維菌素原料增重百分率

2.3 高效液相色譜法結(jié)構(gòu)確證 采用2.6項下的高效液相色譜方法，分別取供試品溶液與對照品溶液進樣，采集液相色譜圖，考察供試品溶液主峰與對照品溶液主峰保留時間是否一致。結(jié)果見圖1～圖2，在乙酰氨基阿維菌素含量測定項下的色譜圖中，乙酰氨基阿維菌素原料主峰與對照品溶液主峰的保留時間一致。

圖1 乙酰氨基阿維菌素USP對照品液相色譜圖

圖2 乙酰氨基阿維菌素原料液相色譜圖

2.4 高分辨質(zhì)譜法結(jié)構(gòu)確證

2.4.1 質(zhì)譜條件 模式：ESI正離子模式；毛細管電壓：2kv；錐孔電壓：10v；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：500L/h。

2.4.2 供試品溶液的制備 取乙酰氨基阿維菌素原料25 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，再用20%甲醇溶液稀釋制成每1 mL中含1 μg的溶液，進樣測定分子量。

2.4.3 測定結(jié)果 在該質(zhì)譜條件下，乙酰氨基阿維菌素理論分子量為936.5086，供試品的測定分子量為936.5085(圖3)。供試品的測定分子量與理論值一致。

圖3 乙酰氨基阿維菌素原料質(zhì)譜圖

2.5 質(zhì)量平衡法定值

2.5.1 色譜純度

2.5.1.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters Sunfire C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.1%高氯酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15 min，45%A，55%B；15～25 min，5%A，95%B；25～30 min，45%A，55%B；30～35 min，45%A，55%B)；流速：1.5 mL/min；檢測波長：245 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

2.5.1.2 供試品溶液的制備 取分裝后的乙酰氨基阿維菌素原料25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.1.3 測定結(jié)果 采用峰面積歸一化法分別計算乙酰氨基阿維菌素B1a和B1b的色譜純度，結(jié)果B1a純度為96.60%，B1b純度為2.40%，二者之和為乙酰氨基阿維菌素純度99.00%。

2.5.2 殘留溶劑 據(jù)查閱乙酰氨基阿維菌素原料企業(yè)的生產(chǎn)工藝可知，原料合成過程中所使用的有機溶劑為乙醇、甲醇和丙酮，因此采用頂空氣相色譜法測定這三種有機溶劑的含量。

2.5.2.1 氣相色譜條件 色譜柱：Agilent HP-5色譜柱(5%苯基-95%甲基聚硅氧烷為固定液)；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持10 min，再以每分鐘10 ℃的速率升溫至180 ℃，保持1 min；進樣口溫度：200 ℃；氫火焰離子化檢測器溫度：250 ℃；頂空瓶平衡溫度：80 ℃；平衡時間：30 min。

2.5.2.2 供試品溶液的制備 取分裝后的乙酰氨基阿維菌素原料0.5 g，置20 mL頂空瓶中，精密加入二甲基甲酰胺5 mL，搖勻，即得。

2.5.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取甲醇、乙醇和丙酮各適量，分別用二甲基甲酰胺稀釋制成48 μg/mL的乙醇對照品溶液、8 μg/mL的甲醇對照品溶液和12 μg/mL的丙酮對照品溶液。

2.5.2.4 測定結(jié)果 取對照品溶液和供試品溶液分別頂空進樣測定，結(jié)果供試品中甲醇和丙酮的含量均低于檢測限，因此忽略不計。按外標法計算供試品中乙醇的含量，結(jié)果為0.05%。

2.5.3 水分 照《中國獸藥典》一部附錄0832測定水分，結(jié)果為1.15%。

2.5.4 熾灼殘渣 照《中國獸藥典》一部附錄0841測定殘渣量，結(jié)果為0.02%。

2.5.5 質(zhì)量平衡法計算結(jié)果 質(zhì)量平衡法計算公式為含量=色譜純度×(1-水分-殘留溶劑-熾灼殘渣)×100%，按照這公式分別計算乙酰氨基阿維菌素B1a與B1b的含量，結(jié)果為B1a：96.60%×(1-1.15%-0.05%-0.02%)×100%=95.42%；B1b：2.40%×(1-1.15%-0.05%-0.02%)×100%=2.37%。乙酰氨基阿維菌素(B1a+B1b)含量為97.79%。

2.6 高效液相色譜外標法定值

2.6.1 液相色譜條件 同2.5.1.1項下色譜條件。

2.6.2 供試品溶液的制備 取分裝后的乙酰氨基阿維菌素原料25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.3 對照品溶液的制備 取乙酰氨基阿維菌素USP對照品25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.4 系統(tǒng)適用性溶液的制備 取對照品溶液1.5 mL，置液相進樣瓶中，加1滴1 mol/L氫氧化鈉溶液，放置20 min后進樣。系統(tǒng)適用性溶液色譜圖見圖4，乙酰氨基阿維菌素B1b峰、B1a峰、雜質(zhì)C+D峰和雜質(zhì)E峰的相對保留時間分別為0.77、1.00、1.05和1.29，各峰間分離度均符合要求。

圖4 系統(tǒng)適用性溶液液相色譜圖

2.6.5 方法專屬性研究 為進一步確定雜質(zhì)的分離情況，應(yīng)在測定前進行專屬性試驗考察。在10 mL供試品溶液中分別加入3滴鹽酸、1 mol/L氫氧化鈉溶液和30%過氧化氫溶液，放置30 min后進樣，另取10 mL供試品溶液水浴加熱5分鐘，放冷后進樣測定，結(jié)果乙酰氨基阿維菌素均產(chǎn)生了雜質(zhì)峰，但主峰與雜質(zhì)均能較好地分離，表明該方法具有較好的專屬性，見圖5～圖8。

圖5 酸破壞試驗液相色譜圖

圖6 堿破壞試驗液相色譜圖

圖7 氧化破壞試驗液相色譜圖

圖8 加熱破壞試驗液相色譜圖

2.6.6 測定結(jié)果 由三個不同實驗室按照該方法進行協(xié)作標定，平均結(jié)果為乙酰氨基阿維菌素B1a含量95.79%，B1b含量2.39%。乙酰氨基阿維菌素(B1a+B1b)含量為98.18%。

2.7 穩(wěn)定性影響因素試驗 按《中國獸藥典》一部附錄穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則要求，進行高溫(60 ℃)、高濕(相對濕度90%)和光照(4500lx)試驗的穩(wěn)定性影響因素試驗，分裝后的樣品在放置5 d和10 d后，按2.5.1項下方法考察乙酰氨基阿維菌素的純度變化。純度結(jié)果見表3，高濕條件下樣品幾乎無變化，高溫對樣品略有影響，10 d后純度下降0.28%，光照對樣品影響較大，10 d后純度下降2.10%。

表3 穩(wěn)定性影響因素試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 對照品含量賦值 《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》[4]中列出5種定值方式，單一實驗室通常采用兩種或更多不同原理的獨立參考方法定值。本研究采用質(zhì)量平衡法與高效液相色譜外標法兩種不同原理的定值方法測定乙酰氨基阿維菌素含量，測定結(jié)果基本一致，相互佐證，可以保證定值的準確性。質(zhì)量平衡法通常被認為是一種具有較高準確度的方法，其能夠直接溯源到國際單位制中的質(zhì)量單位，結(jié)果穩(wěn)定性好，測量結(jié)果比其他方法更準確，世界衛(wèi)生組織及歐洲藥典推薦質(zhì)量平衡法為藥品標準物質(zhì)定值方法[5-6]。雖然本研究兩種方法測定結(jié)果基本一致，但考慮到外標法溯源各人間偏差較大，因此本研究最終采用質(zhì)量平衡法的定值結(jié)果對含量進行賦值。

3.2 對照品的穩(wěn)定性 對照品具有較好的穩(wěn)定性是標準物質(zhì)的一個重要前提，使用中需要特別注意穩(wěn)定性問題。本試驗通過對該對照品進行高溫、高濕和光照穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明該對照品對熱和光照均比較敏感，因此應(yīng)避光低溫保存。同時為了保證對照品在保存條件下的含量值的準確性，根據(jù)獸藥標準物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范[7]要求，我們還應(yīng)對制備的對照品進行穩(wěn)定性監(jiān)測，即在規(guī)定的貯存條件下，定期地進行標準物質(zhì)特性值的穩(wěn)定性評估。分析該對照品的特性，由于該對照品采用安瓿分裝，水分、殘留溶劑和殘渣都基本不會發(fā)生變化，因此最能反映該對照品的變化的特性值為純度，因此確定第一次監(jiān)測時間為一年后，以后每年定期測定一次。對該對照品的純度進行考察，由1人進行測定，每次測定平行樣不少于5份，測定的結(jié)果與原純度結(jié)果相對偏差不得大于0.3%。