姚望，闕祖俊，姚嘉良，于盼，羅斌，田建輝,

0 引言

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）發(fā)布的報告顯示，癌癥是全世界的一個主要死因，2020年近1 000萬例（近六分之一）死亡由癌癥導致，其中肺癌患者所占比例最高。雖然近年來惡性腫瘤總體死亡率較前下降，但肺癌造成的死亡人數(shù)仍高居所有惡性腫瘤之首[1]。

流行病學研究顯示，肺癌的發(fā)生與人口老齡化水平關系密切[2-4]，衰老可能是導致肺癌發(fā)病率上升的原因[5]。目前大部分研究都關注免疫衰老與腫瘤發(fā)病的關系，但與腫瘤轉移的聯(lián)系仍不明確。

田建輝教授針對肺癌轉移的亞臨床階段提出“正虛伏毒”是肺癌發(fā)病和轉移的核心病機[6]，其中“正虛”主要指人體增齡性免疫衰老及其誘導的免疫監(jiān)視功能下降和免疫逃逸、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡功能紊亂等，導致人體全身抗癌能力下降，該學說核心論文獲得2019年第四屆科協(xié)優(yōu)秀論文遴選計劃[7]。本研究從免疫衰老介導外周免疫抑制角度揭示“正虛伏毒”的生物學基礎，探索免疫衰老與肺癌轉移的關系，并進一步驗證扶正中藥金復康口服液通過調(diào)控免疫衰老防治肺癌轉移的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及動物

采用小鼠肺腺癌Lewis細胞結合熒光素酶構建2LL-luc-GFP細胞株（由上海中醫(yī)藥大學朱詩國教授贈予）。近交系C57BL/6小鼠購自杭州子源實驗動物科技有限公司[許可證號為SCXK（浙）2019-0004]，雄性，15月齡30只；6月齡50只；2月齡30只。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為無特殊病原體級屏障系統(tǒng)。環(huán)境參數(shù)為溫度（22±2）℃，相對濕度（55±10）%，12 h晝夜交替。小鼠自由攝食和飲水，造模前適應性喂養(yǎng)1周。本實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院實驗動物福利與倫理委員會審核。

1.2 藥物和試劑

FITC Anti-Mo CD3 抗體（批號100204，美國Biolegend公司）。APC Anti-Mo NK1.1抗體（批號108710，美國Biolegend公司）。PE/Cy7 Anti-Mo CD62L抗體（批號B269976，美國Biolegend公司）。PE Anti-Mo CD196抗體（批號B309195，美國Biolegend公司）。PE Anti-Mo CD4抗體（批號1923424，美國Invitrogen公司）。PerCP-Cy5.5 Anti-Hu/Mo CD44抗體（批號2142979，美國Invitrogen公司）。紅細胞裂解液（批號6208846，美國BD公司）。1%鹽酸酒精溶液、蘇木精染液、伊紅染液均購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3 儀器

MCO-18AIC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），5430R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），DMI3000B型熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司），分析型流式細胞儀（FACSVerse flow cytometer，美國BD公司）。

1.4 細胞培養(yǎng)

取培養(yǎng)基DMEM，加10%胎牛血清、1%雙抗（100 u/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素），將消化后的2LL細胞與配置好的培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 小鼠分組

將所有小鼠按照年齡分為15月齡、6月齡、2月齡三組，每組各30只，適應性飼養(yǎng)一周后造模。余下20只6月齡小鼠按照體質(zhì)量分為10個等級，采用隨機數(shù)字法將同一質(zhì)量等級的2只小鼠分為0.9%NaCl組和金復康口服液組，避免小鼠體質(zhì)量差異對實驗結果的影響。適應性飼養(yǎng)一周后開始給藥，兩周后造模。

1.6 構建小鼠肺癌移植瘤模型

將對數(shù)生長期的2LL-luc-GFP細胞消化離心后，用0.9%NaCl重懸，調(diào)整細胞密度為2×106個/毫升。將小鼠用固定器固定后，小鼠尾靜脈注射0.1 ml細胞懸液。

1.7 小鼠給藥方法

將0.9%NaCl組和金復康給藥組小鼠適應性飼養(yǎng)一周后，開始灌胃給藥。金復康給藥組每次灌胃0.2 ml金復康口服液流浸膏（批號：20200704），連續(xù)灌胃42天；0.9%NaCl組每次灌胃等劑量的0.9%NaCl。

1.8 觀察指標及方法

1.8.1 活體成像法 對小鼠腹腔注射熒光素酶底物，濃度為15 mg/ml，注射量10 μl/g，10 min后置入麻醉機，以異氟烷吸入麻醉5 min，再放入活體熒光成像儀，進行圖像拍攝。觀察小鼠肺轉移成瘤情況。

1.8.2 小鼠肺HE染色法 完整分離小鼠的雙肺標本，組織標本用0.9%NaCl清洗后，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明和浸蠟，進行石蠟包埋，切成3.5 μm厚度的切片，HE染色后，用中性樹膠封片。根據(jù)HE染色結果判定小鼠肺轉移發(fā)生情況。

1.8.3 流式細胞術檢測小鼠外周血免疫細胞 潔凈流式上樣管取100 μl小鼠外周血，加入5 μl的BSA封閉5 min。再加入相應抗CD3、CD4、CD44、CD62L、CD196、NK1.1抗體，避光孵育20 min后，加入紅細胞裂解液，裂解8 min，當上樣管細胞懸液澄清時，1 400 r/min離心4 min，棄上清液，加入2 ml PBS重懸清洗，1 400 r/min離心4 min，重復清洗2次后，棄上清液，加入300 μl NS重懸，流式細胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 衰老對小鼠肺癌轉移的影響

通過小鼠尾靜脈注射小鼠肺癌細胞造模后第4周對小鼠進行活體成像分析，結合取材小鼠肺部組織HE染色結果進行統(tǒng)計，結果顯示，15月齡小鼠較2月齡小鼠肺部轉移瘤成瘤率明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.005），6月齡小鼠較2月齡小鼠肺轉移瘤成瘤率差異也具有統(tǒng)計學意義（P=0.03），15月齡小鼠與6月齡小鼠肺轉移瘤成瘤率有差異趨勢，但不具有統(tǒng)計學意義（P=0.472），提示衰老小鼠更容易發(fā)生肺轉移，見圖1。

圖1 小鼠轉移瘤活體成像和HE染色結果Figure 1 In vivo imaging of metastatic tumor in mice and HE staining results

2.2 金復康口服液對小鼠生存率的影響

對實驗小鼠生存時間行Cox分析，結果顯示造模后第9天0.9%NaCl組小鼠開始出現(xiàn)死亡，截至造模后49天，金復康組小鼠死亡3只，0.9%NaCl組死亡5只，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.230），見圖2。

圖2 造模后衰老小鼠累積生存率Figure 2 Cumulative survival ratio of aging mice after modeling

2.3 金復康抗免疫衰老作用

對肺癌轉移及金復康口服液灌胃兩次實驗小鼠取材的外周血進行流式細胞術檢測，結果顯示，衰老小鼠外周血記憶CD4+T細胞出現(xiàn)與免疫衰老相關的比例升高，差異有統(tǒng)計學意義（2月齡vs.6月齡，P=0.041；2月齡vs.15月齡，P=0.041），6月齡與15月齡間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.953），其余記憶效應T細胞未出現(xiàn)顯著免疫衰老表型，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖3。

圖3 流式細胞術檢測小鼠外周血記憶T細胞亞群比例Figure 3 Flow cytometry results for memory T cells subset percentage in peripheral blood of mice

各年齡組小鼠的NK細胞比例隨著小鼠年齡的上升而下降，差異有統(tǒng)計學意義（2月齡vs.15月齡，P<0.001；6月齡vs.15月齡，P=0.001），出現(xiàn)免疫抑制的免疫衰老表征，2月齡與6月齡間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.203）。而金復康口服液灌胃組小鼠較0.9%NaCl組小鼠外周血NK細胞比例升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.029）。說明金復康口服液具有調(diào)控小鼠外周血NK細胞比例，抗免疫衰老作用，見圖4。

圖4 流式細胞術檢測小鼠外周血NK細胞比例的統(tǒng)計結果Figure 4 Flow cytometry results for NK cells percentage in peripheral of mice

3 討論

免疫衰老是衰老的重要特征，這一概念由Walford在1969年提出，被認為在腫瘤發(fā)病過程中起到至關重要的作用[3]。免疫衰老涵蓋各級免疫器官與各種免疫細胞的衰老變化，臨床表現(xiàn)為老年人的抗感染能力降低、疫苗反應減弱、自身免疫性疾病增多、慢性炎性反應持續(xù)和惡性腫瘤發(fā)病率上升等[8]。而衰老會導致腸道菌群失調(diào)、促炎因子分泌增加、氧化應激產(chǎn)生而引起慢性炎性反應狀態(tài)，促進免疫衰老，造成免疫監(jiān)視減弱，促進免疫逃逸。研究顯示，增齡與腸道菌群多樣化呈負相關[9]，衰老的腸道菌群降低了樹突狀細胞對腫瘤特異性CD8+T細胞的誘導，并增強腫瘤病灶中髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）和調(diào)節(jié)性T細胞的浸潤[10]。衰老同樣導致促炎因子TNF-α和IL-6水平增加，導致單核-巨噬細胞活化，進而產(chǎn)生老年人慢性炎性反應狀態(tài)[11]。活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平則與衰老呈正相關，腸道菌群作用機制可能與NADPH氧化酶Nox被激活有關[12]。ROS會通過直接攻擊附近的線粒體膜和線粒體DNA，導致線粒體功能障礙和更多的ROS產(chǎn)生，引起氧化應激，同樣導致腫瘤的發(fā)生[13]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，健康人群隨著年齡增高出現(xiàn)典型的免疫衰老，初始T 細胞（CD4+CD45RA+）、T細胞總群（CD3+）、細胞毒性T細胞（CD3+CD8+）、CD4+/CD8+比值降低，調(diào)節(jié)性T細胞（CD4+CD25+）升高[14-15]，促進了外周免疫抑制環(huán)境的形成，進而導致循環(huán)腫瘤細胞逃逸，引起腫瘤轉移的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老可導致小鼠尾靜脈肺移植瘤成瘤率上升，出現(xiàn)記憶CD4+T細胞比例上升和NK細胞比例下降等免疫衰老表征，而NK細胞豐度下降的免疫抑制正是導致肺癌轉移的關鍵[14]。金復康口服液具有抗肺癌轉移作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)外周血NK細胞比例有關。

《醫(yī)宗必讀》說：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”，說明腫瘤的形成是正氣不足后邪氣內(nèi)侵所致，正虛是腫瘤發(fā)生的前提條件，癌毒是導致腫瘤發(fā)生的根本原因。因虛致瘀，或留或積，久居一處而不散，產(chǎn)生的“癥瘕積聚”。這與現(xiàn)代醫(yī)學認為腫瘤的發(fā)生與機體免疫紊亂變化的前提相一致。而田建輝教授認為“正虛伏毒”不但是腫瘤發(fā)生，也是腫瘤轉移的基本發(fā)病機制，在腫瘤轉移過程中“正虛”主要指人體增齡性免疫衰老及其誘導的免疫監(jiān)視功能下降和免疫逃逸的發(fā)生，導致全身抗癌能力下降，從而不能制約各種毒邪；而“伏毒”指術后患者體內(nèi)已經(jīng)存在發(fā)生轉化的細胞、腫瘤干細胞（cancer stem cell,CSC）和CTC、休眠腫瘤細胞等。本研究從增齡性免疫衰老介導的外周免疫抑制狀態(tài)出發(fā)，驗證了衰老小鼠外周血NK細胞減少和記憶CD4+T細胞增多的“正虛”免疫衰老表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)并證實衰老對于肺癌轉移具有顯著促進作用。同時課題組前期臨床已驗證，扶正中藥金復康具有抗肺癌轉移發(fā)生作用[16]，本研究初步探索了其抗肺癌轉移作用機制主要通過調(diào)節(jié)NK細胞比例，揭示了腫瘤轉移核心病機“正虛伏毒”的生物學基礎和形成機制，豐富了“扶正治癌”的學術思想。