裴正浩，張虎，王鈞，郝陽

0 引言

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制目前尚未完全明確[1]。因胃癌起病隱匿且缺乏高特異性及敏感度的早期分子診斷標(biāo)志物，往往患者一出現(xiàn)癥狀即已進入進展期[2]。因此，尋找胃癌分子標(biāo)志物，進一步探究其發(fā)生發(fā)展機制，對提高患者5年生存率有重要意義。Y-盒結(jié)合蛋白1（Y-box binding protein 1,YBX1）是一種DNA結(jié)合和RNA結(jié)合蛋白，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。Zhang等[4]研究顯示，YBX1在胃癌組織中高表達。叉頭框蛋白A1（forkhead box protein A1,FOXA1）又稱肝細胞核因子3α，屬于FOXA家族成員[5]。Lin等[6]研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXA1過表達可抑制人胃癌細胞增殖。目前對YBX1、FOXA1蛋白表達與胃癌關(guān)系的研究較少。因此本研究對比了YBX1、FOXA1在胃癌組織及癌旁組織中的表達差異，且對二者與胃癌臨床病理特征及預(yù)后間的關(guān)系進行了探究，旨在為胃癌疾病進展提供重要的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月—2016年7月于南陽市中心醫(yī)院住院治療的131例胃癌患者癌組織作為研究對象，患者年齡46～85歲，中位年齡61（60.24±11.70）歲，男70例，女61例。選取各胃癌患者相應(yīng)癌旁組織作為對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)胃鏡活檢及病理組織學(xué)檢查確診，患者符合國家衛(wèi)生健康委員會制定的胃癌診療規(guī)范[7]；（2）經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過（倫理批號：20150326-7308）；（3）初次確診，術(shù)前未進行化療、放療、細胞分子靶向治療等抗腫瘤治療；（4）臨床資料、影像學(xué)資料、隨訪資料齊全者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有其他消化系統(tǒng)疾病者；（2）有精神障礙性疾病者，哺乳、妊娠期婦女；（3）伴有嚴(yán)重心、肝、腎等臟器病變或其他部位惡性腫瘤者；（4）有胃鏡檢查禁忌證者。收集患者年齡、性別、Lauren分型、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等一般臨床資料。

1.2 主要試劑與儀器

YBX1抗體（貨號：FNab09561）購自武漢菲恩生物科技有限公司；FOXA1抗體（貨號：PAab03187）購自武漢維克賽思科技有限公司；生物素二抗（貨號：GtxOt-070-DFITC）購自廣東固康生物科技有限公司；RNA提取試劑盒（貨號：R3724）購自北京康瑞納生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：J-SRP1105-100）購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；SYBR Green Master Mix（貨號：11201ES-）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。生物顯微鏡（型號：CX43）購自日本OLYMPUS公司；qRT-PCR儀（型號：7500）購自美國ABI公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 采集胃癌患者術(shù)中癌組織及相應(yīng)癌旁組織，所有組織標(biāo)本采用4%多聚甲醛鹽酸緩沖液固定，經(jīng)脫水、透明、包埋后，進行切片（0.4 μm）。

1.3.2 實時熒光定量PCR 法檢測組織YBX1 mRNA、FOXA1 mRNA水平 RNA提取試劑盒提取組織總RNA，檢測濃度和純度后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計軟件設(shè)計引物后委托上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1。體系：上下游引物（10 μmol/L）各2 μl，SYBR Green Master Mix 25 μl，cDNA（50 ng/μl）5 μl，ddH2O 16 μl。程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)。2-??CT法計算YBX1 mRNA、FOXA1 mRNA相對表達量，GAPDH作為內(nèi)參基因。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測YBX1、FOXA1蛋白表達水平 組織標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟至水，置于3%過氧化氫中孵育10 min，PBS緩沖液洗滌。微波爐抗原熱修復(fù)后滴加正常山羊血清（封閉20 min），棄去血清，滴加提前稀釋好的一抗（YBX1、FOXA1抗體，稀釋比均為1:100），PBS代替一抗作為陰性對照，37℃孵育2 h后采用PBS緩沖液洗滌，滴加生物素二抗后室溫下孵育30 min，PBS緩沖液洗滌，DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封片。

選取10個含有陽性細胞的高倍視野分別計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞百分率。陽性細胞百分率<5%計0分、5%～25%計1分、≥25%～50%計2分、≥50%～75%計3分、≥75%計4分。染色程度無陽性著色時計0分、淺黃色計1分、深黃色計2分、棕黃色計3分。將陽性細胞百分率得分與染色程度得分相乘，分值≥6分則判定為陽性（+），<6分則判定為陰性（－）[8]。

1.3.4 隨訪 所有胃癌患者均于術(shù)后5年內(nèi)采用電話、郵件及患者自覺入院檢查等方式進行系統(tǒng)隨訪，術(shù)后第1～3年平均每3個月隨訪1次，之后每半年隨訪1次。生存期從手術(shù)之日起計算，隨訪時間為2015年1月—2021年7月，所有患者均未失訪。中位隨訪時間為23（4～60）個月。隨訪期間42例存活，89例死亡，其死亡原因均為胃癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較行配對χ2檢驗；胃癌患者癌組織YBX1與FOXA1 mRNA和蛋白表達的相關(guān)性分別采用Pearson法及Spearman法分析；Kaplan-Meier法分析胃癌組織YBX1、FOXA1蛋白表達與患者5年總生存率的關(guān)系；單因素及多因素Cox回歸分析影響胃癌患者預(yù)后的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中YBX1 mRNA、FOXA1 mRNA水平比較

與癌旁組織相比，胃癌組織中FOXA1 mRNA水平較低，YBX1 mRNA水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見表2。胃癌組織中YBX1、FOXA1均定位于細胞質(zhì)，見圖1。

圖1 胃癌組織中YBX1陽性(A)和陰性(B)表達、FOXA1陽性(C)和陰性(D)表達 (IHC ×400)Figure 1 Positive(A) and negative(B) expression of YBX1,positive(C) and negative(D) expression of FOXA1 in gastric cancer tissues (IHC ×400)

表2 胃癌患者癌組織與癌旁組織中YBX1 mRNA、FOXA1 mRNA水平比較 ()Table 2 Comparison of YBX1 mRNA and FOXA1 mRNA levels between cancer tissues and adjacent tissues in patients with gastric cancer ()

表2 胃癌患者癌組織與癌旁組織中YBX1 mRNA、FOXA1 mRNA水平比較 ()Table 2 Comparison of YBX1 mRNA and FOXA1 mRNA levels between cancer tissues and adjacent tissues in patients with gastric cancer ()

2.2 胃癌組織YBX1 mRNA與FOXA1 mRNA的相關(guān)性

Pearson法分析結(jié)果顯示，胃癌組織YBX1 mRNA與FOXA1 mRNA負相關(guān)（r=-0.675,P<0.05），見圖2。

圖2 胃癌組織YBX1 mRNA與FOXA1 mRNA的相關(guān)性Figure 2 Correlation between YBX1 mRNA and FOXA1 mRNA in cancer tissues of patients with gastric cancer

2.3 胃癌組織與癌旁組織中YBX1、FOXA1蛋白表達比較

與癌旁組織相比，癌組織中FOXA1蛋白陽性表達率較低，YBX1蛋白陽性表達率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 胃癌患者癌組織與癌旁組織中YBX1和FOXA1蛋白的表達 (n(%))Table 3 Expression of YBX1 and FOXA1 protein in cancer tissues and adjacent tissues of patients with gastric cancer(n(%))

2.4 胃癌組織YBX1與FOXA1蛋白表達的相關(guān)性

Spearman法分析結(jié)果顯示，胃癌組織中YBX1與FOXA1蛋白表達負相關(guān)（Crammer's V=-0.497,P<0.001），見表4。

表4 胃癌患者癌組織YBX1與FOXA1蛋白表達的相關(guān)性Table 4 Correlation between the expression of YBX1 and FOXA1 protein in cancer tissues of patients with gastric cancer

2.5 胃癌組織中YBX1、FOXA1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，胃癌組織中YBX1、FOXA1蛋白表達與患者年齡、性別、Lauren分型、腫瘤大小無關(guān)（P>0.05），與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P<0.001），見表5。

表5 胃癌組織YBX1、FOXA1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 (n(%))Table 5 Relationship between YBX1,FOXA1 protein expression in gastric cancer tissues and clinicopathological features of patients with gastric cancer (n(%))

2.6 胃癌患者Kaplan-Meier生存分析

結(jié)果顯示，YBX1陰性表達組5年內(nèi)存活率（17/33,51.52%）高于YBX1陽性表達組（25/98,25.51%）（χ2=7.665,P<0.05），F(xiàn)OXA1陽性表達組5年內(nèi)存活率（26/63,41.27%）高于FOXA1陰性表達組（16/68,23.53%）（χ2=4.725,P<0.05），見圖3。

圖3 胃癌組織YBX1(A)、FOXA1(B)表達與患者5年總生存率的關(guān)系Figure 3 Relationship between YBX1(A),FOXA1(B)expression in gastric cancer tissues and 5-year overall survival rate

2.7 影響胃癌患者預(yù)后的單因素及多因素Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、YBX1是胃癌患者死亡的危險因素（P<0.05），腫瘤分化程度、FOXA1是胃癌患者死亡的保護因素（P<0.05）。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期、YBX1是胃癌患者死亡的獨立危險因素（P<0.05），F(xiàn)OXA1是胃癌患者死亡的保護因素（P<0.05），見表6～7。

表6 影響胃癌患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析Table 6 Univariate Cox regression analysis for prognosis of gastric cancer patients

表7 影響胃癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析Table 7 Multivariate Cox regression analysis for prognosis of gastric cancer patients

3 討論

胃癌死亡率較高，嚴(yán)重威脅人類的生存及健康，盡管治療方法已取得突破性的發(fā)展，但預(yù)后情況并不樂觀[9-10]。目前研究顯示，胃癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因的表達、抑癌基因的失活及多種信號通路的活化有關(guān)，相關(guān)基因的重點研究可能對預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)有重要意義[11]。

FOXA1是FOXA家族中的重要成員，研究表明，F(xiàn)OXA亞族蛋白與胃腸道產(chǎn)黏蛋白杯狀細胞及腸道內(nèi)分泌細胞的發(fā)育有重要聯(lián)系，而腸道中此類細胞丟失與營養(yǎng)吸收不足有關(guān)[12-13]。FOXA1可通過與染色體特異結(jié)合，釋放結(jié)合位點，調(diào)控細胞增殖、凋亡等過程[14]。Lazar等[15]研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXA1在正常人結(jié)腸中高表達，而在結(jié)直腸癌中表達顯著下調(diào)。YBX1是一種參與細胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)及惡性細胞轉(zhuǎn)化等過程的多功能癌蛋白，且不同類型的癌癥細胞增殖中YBX1參與調(diào)控的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑亦不同[16-17]。因此，YBX1可作為許多癌癥進展的生物標(biāo)志物。Zhang等[18]研究結(jié)果顯示，LncRNA DSCAM-AS1通過形成激活FOXA1轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的正反饋環(huán)，與YBX1相互作用以促進部分癌癥進展。而本研究結(jié)果中，YBX1蛋白、YBX1 mRNA在胃癌組織中表達上調(diào)，F(xiàn)OXA1蛋白、FOXA1 mRNA表達下調(diào)，且YBX1、FOXA1蛋白及mRNA表達水平均負相關(guān)，提示YBX1可能通過負反饋影響FOXA1，F(xiàn)OXA1通過與染色體特異結(jié)合，釋放DNA結(jié)合位點，參與調(diào)控下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細胞增殖、凋亡等過程，進而參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究中YBX1、FOXA1兩種蛋白表達與胃癌組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有相關(guān)性，提示YBX1、FOXA1可能通過相互作用，減少細胞生長阻滯，增強了胃癌細胞的增殖、分化能力，促使胃癌惡性進展。進一步提示YBX1、FOXA1有可能作為評估胃癌疾病進展的生物指標(biāo)。Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，YBX1表達上調(diào)、FOXA1表達下調(diào)可能與胃癌患者不良預(yù)后有關(guān)，且二者均是胃癌患者死亡的影響因素，推測YBX1、FOXA1可能參與胃癌細胞的侵襲遷移，進而促使胃癌復(fù)發(fā)，造成患者死亡，臨床中可將兩者作為患者預(yù)后預(yù)測的參考靶標(biāo)。

綜上所述，胃癌組織中YBX1蛋白表達上調(diào)、FOXA1蛋白表達下調(diào)，二者表達水平與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后有關(guān)。YBX1、FOXA1有可能作為判斷胃癌疾病進展及預(yù)后的指標(biāo)，為胃癌的治療提供新的靶基因。但由于本研究隨訪時間相對較短、樣本量相對較少，且未能避免排除部分病例后對統(tǒng)計結(jié)果造成的偏倚，今后將進行多中心、大樣本量的研究進一步驗證。