唐園惠，朱圣明，柴晶晶，韓佳慧，田超，鄧鑫州，段奇文

0 引言

肺癌是世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最常見(jiàn)的病理類(lèi)型[2]。放療是肺癌治療的重要手段之一，但放射抵抗的存在往往限制了非小細(xì)胞肺癌治療效果，因此探尋肺癌放療抵抗的新靶標(biāo)及其潛在分子機(jī)制有著重要意義。

整合素是一種跨膜黏附受體，由α和β兩個(gè)亞基組成。細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附主要通過(guò)整合素家族實(shí)現(xiàn)[3]。整合素可以與多種胞質(zhì)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，將信號(hào)從胞內(nèi)區(qū)傳遞到胞外區(qū)，介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞遷移、侵襲、分化、增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)中發(fā)揮重要作用[4]。整合素信號(hào)增強(qiáng)了癌細(xì)胞抵抗化學(xué)療法和放射療法有害作用的能力[5]。Integrin αV（ITGAV）屬于整合素家族一員，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)，但其與NSCLC放射抵抗的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析ITGAV在NSCLC中的表達(dá)及與患者生存之間的關(guān)系，并在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了ITGAV對(duì)NSCLC細(xì)胞放射敏感度的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人肺腺癌細(xì)胞株H1299、A549購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。ITGAV-siRNA-2913、ITGAV-siRNA-1951、ITGAV-siRNA-1312和陰性對(duì)照Negative control FAM均由上海吉瑪公司合成?？贵w均購(gòu)自美國(guó)BOSTER公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。蛋白裂解液RIPA、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒等均購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 進(jìn)入GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/），輸入基因名稱(chēng)ITGAV后，在Datasets Selection窗口選擇“LUAD”、“LUSC”；設(shè)置臨界值設(shè)定條件（｜Log2FC｜Cutoff：0.5，Pvalue Cutoff：0.05），點(diǎn)擊“plot”獲取基因表達(dá)差異圖譜。

1.2.2 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 進(jìn)入HPA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.proteinatlas.org/），輸入基因ITGAV后，點(diǎn)擊search，點(diǎn)擊“tissue”進(jìn)入組織圖譜，點(diǎn)擊“l(fā)ung”，獲取相應(yīng)的免疫組織化學(xué)切片。

1.2.3 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線(xiàn)生存分析 進(jìn)入Kaplan-Meier Plotter [Lung Cancer]欄目（http:/kmplot.com/analysis/index.php?p=service&ca ncer=lung），輸入基因ITGAV后，在Survival窗口選擇總生存期（OS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS），在Radiotherapy窗口選擇yes，點(diǎn)擊Draw Kaplan Meier-plotter，獲取生存曲線(xiàn)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 利用FBS濃度為10%的DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)A549、A549R、H1299和H1299R細(xì)胞。

1.2.5 非小細(xì)胞肺癌放射抵抗株A549R和H1299R細(xì)胞的構(gòu)建 將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H1299細(xì)胞（5×106個(gè)/瓶）接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)均加入4 ml含PFS為10%的DMEM培養(yǎng)液，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，2 Gy劑量X射線(xiàn)累計(jì)照射28次，總劑量達(dá)到56 Gy（照射能量6 MV，照射距離100 cm，照射野15 cm×15 cm，劑量率2 Gy/min，放療設(shè)備Varian Unique），每次照射完畢后繼續(xù)恒溫箱中培養(yǎng)。照射完畢，對(duì)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞進(jìn)行單克隆，穩(wěn)定傳代，得到肺癌放射抵抗株A549R和H1299R。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為ITGAV干擾組和陰性對(duì)照組。培養(yǎng)A549R和H1299R細(xì)胞使其融合度達(dá)50%～70%時(shí)，ITGAV siRNA轉(zhuǎn)染：siITGAV的三條干擾序列為：ITGAV-siRNA-2913（F: 5′-CCAC AUUGGUUACCACUAATT-3′，R: 5′-UUAGUGG UAACCAAUGUGGTT-3′）；ITGAV-siRNA-1951（F: 5′-CCCUCUGACAUUGAUUGUUTT-3′，R: 5′-AACAAUCAAUGUCAGAGGGTT-3′）；ITGAV-siRNA-1312（F: 5′-GCAGGUCUCAGUGU CUCUATT-3′，R: 5′-UAGAGACACUGAGACCUG CTT-3′）。陰性對(duì)照（negative control,NC）序列為：F: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，R:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549R和H1299R細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/毫升，接種在6孔板上，按照siRNA mate說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染siITGAV和NC組細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48和72 h后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) qRT-PCR實(shí)驗(yàn)收集處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549R和H1299R細(xì)胞，裂解后依據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。ITGAV引物序列：F: 5'-ATCTGTGAGGTCGAAACAGGA-3'，R：5'-TGGAGCATACTCAACAGTCTTTG-3'；GAPDH引物序列：F：5'-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3'，R：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCA TGG-3'。GAPDH為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計(jì)算ITGAV相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 蛋白提取及Western blot檢測(cè) 收集約1×106個(gè)細(xì)胞，提取蛋白，使用BCA法進(jìn)行定量，取10 μl蛋白，10%SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后室溫下于5%的脫脂奶粉中封閉2 h。4℃條件下一抗孵育8 h，室溫條件下二抗孵育2 h，ECL試劑盒顯影。ImagePro Plus 6.0 軟件統(tǒng)計(jì)目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值，兩者之比即為目的蛋白表達(dá)量。

1.2.9 克隆形成實(shí)驗(yàn) ITGAV siRNA和NC轉(zhuǎn)染A549R和H1299R細(xì)胞后，經(jīng)0、2、4、6、8 Gy照射，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以1×103個(gè)/孔密度傳代培養(yǎng)于6孔板中，37℃、5%CO2恒定培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10天，直到細(xì)胞長(zhǎng)出新的集落，固定，結(jié)晶紫染色后顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.2.10 細(xì)胞凋亡檢測(cè) A549R和H1299R細(xì)胞經(jīng)ITGAV siRNA、NC轉(zhuǎn)染后，采用6 Gy X射線(xiàn)照射細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后離心，收集細(xì)胞，PBS預(yù)冷，洗3遍。依照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，依次進(jìn)行Annexin V和PI雙染色，流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。

1.2.11 細(xì)胞周期檢測(cè) A549R和H1299R細(xì)胞經(jīng)ITGAV siRNA、NC轉(zhuǎn)染，采用6 Gy X線(xiàn)照射后，收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗3遍。4℃冰箱70%冷乙醇固定過(guò)夜，根據(jù)細(xì)胞周期試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，按順序進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.04軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較使用單因素方差分析,兩組間比較使用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中ITGAV高表達(dá)

對(duì)TCGA的肺腺癌（共594例，包括59例正常組織和535例肺腺癌組織）及肺鱗癌（共551例，包括49例正常組織和502例肺鱗癌組織）數(shù)據(jù)的查詢(xún)顯示，ITGAV在肺腺癌（圖1A）和肺鱗癌（圖1B）中過(guò)表達(dá)（P<0.001）。從HPA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的免疫組織化學(xué)染色數(shù)據(jù)顯示，ITGAV蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)高于正常組織（圖1C）。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(A,B)和HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(C)分析ITGAV在肺腺癌和肺鱗癌組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of ITGAV in lung adenocarcinoma(LUAD) and lung squamous cell carcinoma (LUSC) analyzed using TCGA database(A,B) and HPA database(C)

2.2 NSCLC組織中ITGAV高表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

ITGAV高表達(dá)與肺腺癌患者的OS（HR=1.47,P=0.0091）和RFS（HR=1.78,P=0.0076）不良密切相關(guān)，見(jiàn)圖2A～B。但I(xiàn)TGAV的表達(dá)與肺鱗癌患者的OS（HR=1.22,P=0.21）和RFS（HR=1.64,P=0.082）無(wú)明顯相關(guān)性，見(jiàn)圖2C～D。提示ITGAV在肺腺癌組織中高表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)。

圖2 利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析ITGAV表達(dá)水平與肺腺癌(A,B)、肺鱗癌(C,D)患者預(yù)后關(guān)系Figure 2 Relationship between ITGAV expression and prognosis of patients with LUAD(A,B) or LUSC(C,D)analyzed using Kaplan-Meier Plotter database

2.3 A549R和H1299R細(xì)胞放射敏感度檢測(cè)

與親本細(xì)胞相比，A549R和H1299R細(xì)胞經(jīng)過(guò)X射線(xiàn)照射后其放療抵抗能力增加，見(jiàn)圖3。

圖3 A549、A549R(A)和H1299、H1299R(B)照射后細(xì)胞存活曲線(xiàn)Figure 3 Survival curves of A549,A549R(A),H1299,and H1299R cells(B) after irradiation

2.4 ITGAV在A549R和H1299R細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示ITGAV在A549R細(xì)胞中的表達(dá)高于A549細(xì)胞（P=0.0003），在H1299R細(xì)胞中的表達(dá)高于H1299細(xì)胞（P<0.0001），見(jiàn)圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)A549、A549R、H1299和H1299R細(xì)胞ITGAV的表達(dá)水平Figure 4 Expression of ITGAV in A549,A549R,H1299,and H1299R cells detected by Western blot analysis

2.5 si-RNA轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

為了研究ITGAV在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞輻射抗性中的生物學(xué)功能，我們用對(duì)照（NC）或si-RNA載體（siITGAV-2913、siITGAV-1951、siITGAV-1312）轉(zhuǎn)染A549R和H1299R細(xì)胞。通過(guò)qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。qRTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與NC組（0.96±0.030）相比、siITGAV-2913組（0.32±0.017）、siITGAV-1951組（0.18±0.011）、siITGAV-1312組（0.2367±0.012）mRNA在A549R中相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.0001），見(jiàn)圖5A；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：A549R和H1299R細(xì)胞中，siITGAV-1951、siITGAV-1312、si-ITGAV-2913均顯著抑制了ITGAV蛋白水平的表達(dá)，而siITGAV-1951無(wú)論是在A549R還是H1299R細(xì)胞中，沉默效果最佳（P<0.0001），見(jiàn)圖5B～E。因此，我們選擇siITGAV-1951進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

圖5 qRT-PCR(A)和Western blot(B～E)檢測(cè)siITGAV的干擾效果Figure 5 Interference effects of siITGAV detected by qRTPCR(A) and Western blot(B-E) analyses

2.6 抑制ITGAV對(duì)肺腺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)0、2、4、6、8 Gy X線(xiàn)照射，ITGAV干擾組細(xì)胞的克隆形成能力明顯低于陰性對(duì)照組（P均<0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同劑量照射下ITGAV對(duì)肺腺癌細(xì)胞H1299R(A)和A549R(B)克隆形成能力的影響Figure 6 Survival of H1299R(A) and A549R(B) cells in each group detected by cloning formation assay after irradiation

2.7 抑制ITGAV對(duì)肺腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀凋亡分析顯示，ITGAV在無(wú)照射條件下對(duì)NSCLC細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。然而，6 Gy X線(xiàn)照射48 h后，A549R-siITGAV和H1299RsiITGAV 組的凋亡細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組（PH1299R<0.0001,PA549R=0.0002），見(jiàn)圖7A～B。經(jīng)6 Gy X線(xiàn)照射后，A549R-siITGAV和H1299RsiITGAV細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞比例高于陰性對(duì)照組（PH1299R<0.0001,PA549R=0.0007），見(jiàn)圖7C～D。這些結(jié)果表明，ITGAV干擾后肺腺癌細(xì)胞凋亡率增加、阻滯于G2/M期的細(xì)胞增加。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ITGAV干擾對(duì)肺腺癌細(xì)胞凋亡(A,B)、周期(C,D)的影響Figure 7 Cell apoptosis(A,B) and cycle(C,D) in each group detected by flow cytometry

3 討論

腫瘤放射抵抗是一個(gè)多基因共同調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程。文獻(xiàn)證實(shí)放療抵抗的發(fā)生與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯、乏氧、逃避凋亡、線(xiàn)粒體能量改變、腫瘤干細(xì)胞增殖、亞克隆形成等多種因素相關(guān)[6]。因此，研究非小細(xì)胞肺癌放射抵抗的分子生物學(xué)機(jī)制，尋找放療抵抗新靶點(diǎn)對(duì)提高放射敏感度尤為重要。整合素是一種跨膜糖蛋白，其在腫瘤細(xì)胞黏附、改變腫瘤細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生成、介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[7]。ITGAV作為整合素家族一員，目前已被證實(shí)與前列腺癌[8]、胰腺癌[9]和肝癌[10]的侵襲、擴(kuò)散或不良預(yù)后有關(guān)。Cheuk等[11]研究顯示整合素ITGAV的沉默通過(guò)改變BCL2和PXN的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和自我更新。但I(xiàn)TGAV在非小細(xì)胞肺癌放射抵抗中的作用尚不清楚。

本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，與正常肺組織相比，整合素ITGAV在肺腺癌和肺鱗癌組織中表達(dá)明顯增加，HPA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的免疫組織化學(xué)染色數(shù)據(jù)也表明ITGAV蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)高于正常組織，并且通過(guò)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)ITGAV高表達(dá)與肺腺癌患者較短O(píng)S和RFS有關(guān)。這些結(jié)果與Loeser等[12]研究結(jié)果一致。

為進(jìn)一步研究ITGAV與NSCLC放射抵抗關(guān)系，本研究干擾了ITGAV在A549R和H1299R細(xì)胞中的表達(dá)，經(jīng)不同劑量照射后，發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量增加，干擾組及對(duì)照組克隆存活率均顯著降低，但與NC組相比，si-ITGAV組克隆形成率下降更為明顯。這與Lee等[13]研究結(jié)果相似。他們發(fā)現(xiàn)沉默ITGAV后，STAT5的磷酸化下降，NSCLC克隆形成率明顯減低。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)6 Gy X線(xiàn)照射后，si-ITGAV組凋亡率、G2/M期阻滯增加，證明ITGAV的沉默與NSCLC較低克隆存活率、對(duì)輻射誘導(dǎo)的凋亡抵抗力下降以及G2/M期阻滯有關(guān)。Li等[14]研究ITGB1與NSCLC放射抵抗關(guān)系時(shí)也有相似的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)沉默ITGB1后，A549R和H460R細(xì)胞的克隆形成存活率下降，并且與照射后的野生型細(xì)胞相比，細(xì)胞凋亡率及G2/M期阻滯增加。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了ITGAV在非小細(xì)胞肺癌放射抵抗中的作用，但I(xiàn)TGAV介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌放射抵抗的具體分子機(jī)制尚未闡明，今后，我們將在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究整合素ITGAV及其他成員在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，為解決臨床NSCLC放療抵抗問(wèn)題提供有利線(xiàn)索和可靠依據(jù)。