許文秀，尚兆萌，劉佳林，王東浩，陳淑鑫，畢素素，鞏秀美，劉 林，張桂芝

（臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東臨沂 276005）

杜仲是國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，為我國(guó)特有樹(shù)種，是名貴中藥材和保健食料，食用杜仲有補(bǔ)養(yǎng)肝腎、強(qiáng)筋健骨的功效。杜仲的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子都積累杜仲膠[1-5]。杜仲膠與天然橡膠化學(xué)組成相同，都是異戊二烯聚合物，前者是反式-聚異戊二烯，后者是順式-聚異戊二烯[6]。作為天然高分子材料，這種反式-聚異戊二烯受到了高度重視[7]。

定量分析結(jié)果表明，成熟杜仲葉含膠量幾乎達(dá)到干質(zhì)量的1%，衰老葉中含量超過(guò)1%。通過(guò)石蠟制片技術(shù)所做的觀察證實(shí)，積累杜仲膠的細(xì)胞（含膠細(xì)胞）僅局限于韌皮部較窄的韌皮薄壁細(xì)胞，離析法研究表明含膠細(xì)胞是細(xì)長(zhǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞被膠充滿[1-3,5]。含膠細(xì)胞也許不只局限于韌皮部窄小細(xì)胞，但因石蠟制片技術(shù)局限性，未被膠充滿的細(xì)胞觀察不到，因?yàn)槭炛破^(guò)程中，高度液泡化的細(xì)胞如葉肉細(xì)胞和表皮細(xì)胞，極易發(fā)生質(zhì)壁分離，細(xì)胞質(zhì)收縮成一團(tuán)，從而影響對(duì)膠的觀察。與石蠟制片技術(shù)相比，塑料制片技術(shù)有明顯優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存完整，不容易發(fā)生胞質(zhì)收縮。為明確含膠細(xì)胞的分布范圍，有必要采用塑料制片技術(shù)對(duì)杜仲葉含膠細(xì)胞做進(jìn)一步觀察。

對(duì)橡膠樹(shù)細(xì)胞內(nèi)橡膠的電鏡觀察表明，積累橡膠的細(xì)胞器是脂滴[8-9]，脂滴是一種由磷脂單分子層和蛋白質(zhì)圍成的小泡[10]。甘油三酯[10-13]和蠟[14]也都在脂滴中積累。因?yàn)槎胖倌z與橡膠是順?lè)串悩?gòu)體，故推測(cè)杜仲膠也可能在脂滴內(nèi)積累。前人用石蠟制片技術(shù)沒(méi)有分辨出積累杜仲膠的脂滴（膠滴），可能與石蠟制片技術(shù)的局限性有關(guān)。

透射電鏡觀察表明，積累橡膠的脂滴內(nèi)部電子密度相對(duì)較低，表面電子密度相對(duì)較高[9]。積累甘油三酯[10-13]和蠟[14]的脂滴，雖然形狀類(lèi)似，但表面電子密度比橡膠滴低。杜仲膠是橡膠的順?lè)串悩?gòu)體，積累杜仲膠的脂滴可能與積累橡膠的橡膠滴具有非常接近的超微特征。為證實(shí)杜仲膠滴是否有與橡膠滴類(lèi)似的超微特征，有必要借鑒細(xì)胞內(nèi)橡膠電鏡觀察技術(shù)對(duì)杜仲膠進(jìn)行超微觀察。杜仲膠是不飽和脂類(lèi)，本實(shí)驗(yàn)基于不飽和脂類(lèi)的組織化學(xué)方法，采用四氧化鋨處理杜仲葉片，然后用塑料制片技術(shù)制片以觀察杜仲膠，研究其含膠細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliver），種植于臨沂大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)與科研基地，樹(shù)齡15 年。主要試劑包括戊二醛（Pella INC），四氧化鋨，Epon-812（EMS），醋酸雙氧鈾（EMS），檸檬酸鉛（EMS），甲苯胺藍(lán)O（上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

超薄切片機(jī)，Ultracut R，Leica Instrument Shanghai Ltd；透射電子顯微鏡，Tecnai 12，F(xiàn)EI 電子光學(xué)有限公司。

1.3 方法

杜仲膠與天然橡膠是順?lè)串悩?gòu)體，前人對(duì)橡膠做過(guò)電鏡觀察[8-9]，本實(shí)驗(yàn)借鑒同樣方法觀察杜仲膠。取杜仲葉，切成小塊，置于2%戊二醛溶液中處理12 h，再轉(zhuǎn)入1%四氧化鋨（Pella INC）溶液中處理4 h[15]，樣品脫水后包埋于Epon-812 樹(shù)脂（EMS）中。用超薄切片機(jī)切薄切片（厚度1 μm）和超薄切片（厚度60～70 nm）。薄切片不染色或用甲苯胺藍(lán)-O 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，如果有膠滴，將會(huì)顯示棕色，據(jù)此可以了解含膠細(xì)胞的分布范圍，即杜仲膠在哪些組織中分布。超薄切片用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛（EMS）做電子染色，于透射電子顯微鏡下觀察膠滴。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉片顯微結(jié)構(gòu)

杜仲葉片由表皮、葉肉和葉脈組成（圖1）。表皮組織含有表皮細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞，下表皮細(xì)胞略小。葉肉組織分化為柵欄組織和海綿組織，海綿組織厚度約為柵欄組織的2 倍。柵欄細(xì)胞呈圓柱形，長(zhǎng)60～80μm，直徑15～20 μm，排列較緊密。海綿細(xì)胞形狀不規(guī)則，排列疏松，細(xì)胞間隙大。葉脈構(gòu)成網(wǎng)狀脈序，較大的葉脈由維管束與支持組織構(gòu)成，支持組織位于維管束與表皮之間。支持細(xì)胞與葉肉細(xì)胞的區(qū)別主要表現(xiàn)在前者不含葉綠體，沒(méi)有細(xì)胞間隙或細(xì)胞間隙較小。小葉脈僅含維管束，且維管束也較小。有些葉肉細(xì)胞緊密排列在維管束周?chē)纬删S管束鞘。

圖1 葉片顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Microscopic structure of Ecommia leaf blade

2.2 含膠細(xì)胞

葉片內(nèi)有大量含膠細(xì)胞，可按照液泡發(fā)育情況歸為非液泡化含膠細(xì)胞與液泡化含膠細(xì)胞，前者不含大液泡，后者含中央大液泡。

非液泡化含膠細(xì)胞是韌皮部中那些直徑較小的韌皮薄壁細(xì)胞，直徑只有附近液泡化含膠薄壁細(xì)胞的1/5～1/2，光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)部空間被膠填滿，分辨不出膠滴輪廓（圖2A、B）；透射電鏡下觀察，膠滴輪廓分明，彼此分離，但間距很?。s0.04 μm）（圖3A、B）。細(xì)胞每張切片上可見(jiàn)數(shù)個(gè)膠滴，膠滴大小不等，小至0.2 μm，大到4～5 μm。

圖2 韌皮部?jī)煞N含膠細(xì)胞Fig.2 Microscopic structure of phloem and gutta distribution

圖3 韌皮部非液泡化含膠細(xì)胞Fig.3 Non-vacuolated gutta-containing cells in the phloem

液泡化含膠細(xì)胞既包括韌皮高度液泡化的薄壁細(xì)胞（圖2），也包括葉肉細(xì)胞、表皮細(xì)胞（圖2、4）以及表皮與維管束之間的支持細(xì)胞（圖1）。這些含膠細(xì)胞中的膠滴在光鏡下即可分辨（圖1、2、4），與非液泡化含膠細(xì)胞明顯不同。在韌皮部液泡化的含膠細(xì)胞內(nèi)，膠粒通常聚集成堆，從斜切片上較容易觀察到（圖2B）。在葉肉細(xì)胞中，膠滴傾向于聚集在細(xì)胞周?chē)?，特別是海綿細(xì)胞內(nèi)容易觀察到這一現(xiàn)象（圖4B，5A、B）。柵欄細(xì)胞積累大量單寧（圖1），膠滴顯得較少，膠滴輪廓清楚（圖4A）。上表皮（圖4C）和下表皮（圖4D）中的膠滴同樣有較清楚的輪廓。保衛(wèi)細(xì)胞中的膠滴形狀不規(guī)則，類(lèi)似變形蟲(chóng)（圖6A、B）。

圖4 液泡化含膠細(xì)胞Fig.4 Vacuolated gutta-containing cells

圖5 葉肉細(xì)胞內(nèi)膠滴聚集在細(xì)胞核表面Fig.5 Gutta-accumulating lipid droplets gather around the nucleus

圖6 保衛(wèi)細(xì)胞中的膠滴Fig.6 Gutta-accumulating lipid droplets in guard cells

2.3 膠滴的超微特征

在液泡化含膠細(xì)胞內(nèi)，膠滴常常突入液泡內(nèi)（圖7A、B）。雖然進(jìn)入液泡內(nèi)，膠滴仍然被一層極薄的細(xì)胞質(zhì)包圍著（圖7B），并且通過(guò)細(xì)胞質(zhì)細(xì)絲與細(xì)胞邊緣的細(xì)胞質(zhì)相連（圖7A）。由于有細(xì)胞質(zhì)圍繞著膠滴，所以看似位于液泡中的膠滴實(shí)際上沒(méi)有與液泡內(nèi)的液體接觸。

圖7 膠滴進(jìn)入液泡Fig.7 Gutta-accumulating lipid droplets in the vacuole

電鏡下用較高的倍數(shù)觀察，各種細(xì)胞中的脂滴，除個(gè)別外，大都具有電子染色較深的表面，而內(nèi)部電子染色較淺（圖3、5B、7、8），特別面向小泡（見(jiàn)下頁(yè)圖8A）或液泡（圖8B）的區(qū)域電子密度非常高，密布粗糙的嗜鋨顆粒，但是尚不清楚產(chǎn)生這些顆粒的原因。

圖8 膠滴特征Fig.8 Characteristic of the gutta-accumulating lipid droplets

3 討論與結(jié)論

3.1 含膠細(xì)胞分布范圍超出過(guò)去的認(rèn)知

本研究首次清楚顯示杜仲葉內(nèi)含膠細(xì)胞包括非液泡化含膠細(xì)胞和液泡化含膠細(xì)胞，前者位于韌皮部，直徑小，不含大液泡，被膠滴充滿，光鏡下分辨不出膠間的界限，只有在電子顯微鏡下才能清晰顯示膠滴的輪廓；后者直徑大，含中央大液泡，能產(chǎn)生膠滴，但不大量積累，表現(xiàn)為膠滴相對(duì)稀疏，或者位于細(xì)胞邊緣，或者聚集于細(xì)胞核周?chē)?，或者進(jìn)入液泡內(nèi)部，即使在光鏡下也能分辨出膠滴輪廓。非液泡化含膠細(xì)胞只是一類(lèi)細(xì)胞，積累膠滴是這類(lèi)細(xì)胞的主要功能；而液泡化含膠細(xì)胞不只是一類(lèi)細(xì)胞，其包括韌皮部直徑較大的薄壁細(xì)胞、葉肉細(xì)胞和表皮細(xì)胞，這些細(xì)胞雖然積累膠滴，但積累膠滴不是主要功能，因?yàn)槿~肉細(xì)胞的主要功能是光合作用，表皮細(xì)胞的主要功能是保護(hù)。

前人用石蠟制片技術(shù)顯示含膠細(xì)胞位于韌皮部，但是沒(méi)有觀察到葉肉細(xì)胞和表皮細(xì)胞積累杜仲膠[1-5]，這可能與石蠟制片技術(shù)的局限性有關(guān)。例如，石蠟制片過(guò)程中高度液泡化的細(xì)胞容易發(fā)生質(zhì)壁分離，一旦發(fā)生質(zhì)壁分離細(xì)胞質(zhì)就會(huì)收縮成一團(tuán)，稀疏的膠滴包裹在細(xì)胞質(zhì)團(tuán)里面，不容易觀察到。本實(shí)驗(yàn)采用戊二醛和四氧化鋨處理葉片組織，用塑料包埋樣品，細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存完整，不發(fā)生細(xì)胞質(zhì)收縮，膠滴輪廓較為清晰，所以能夠在高度液泡化的葉肉細(xì)胞和表皮細(xì)胞中觀察到膠滴。顯然，含膠細(xì)胞分布范圍之廣超出了過(guò)去的認(rèn)知。

3.2 膠滴與積累橡膠的脂滴超微特征相同

本研究清楚顯示出膠滴的超微特征：具有電子密度相對(duì)較低的核和電子密度相對(duì)較高的表面。橡膠樹(shù)積累的天然橡膠的脂滴[8-9]也具有同樣的超微特征。積累甘油三酯的脂滴，如辣椒果實(shí)脂滴[11]和西瓜葉脂滴[12-13]，雖然形狀類(lèi)似，總體上電子密度也類(lèi)似，但是它們的表面與內(nèi)部的反差沒(méi)有膠滴那么大，這是膠滴與積累甘油三酯的脂滴超微特征方面的細(xì)微區(qū)別。脂滴表面有膜結(jié)合蛋白[10,16-18]，膜結(jié)合蛋白與脂滴的功能和行為有關(guān)，比如脂滴間的融合就是受膜蛋白精密調(diào)控的過(guò)程[19]。膜結(jié)合蛋白使脂滴表面電子密度升高，膜結(jié)合蛋白越多，電子密度就越高。因此，膠滴的這一超微特征意味著它表面有更多的膜蛋白。

3.3 膠滴在細(xì)胞核表面聚集的意義

植物暴露于紫外輻射之中，DNA 易受紫外輻射和活性氧的傷害，紫外輻射既能直接破壞DNA 分子結(jié)構(gòu)，又能誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧，間接破壞DNA 分子結(jié)構(gòu)[20]。植物進(jìn)化出多種防御紫外輻射的機(jī)制，如積累能吸收紫外輻射的酚類(lèi)化合物、抗壞血酸、維生素E、類(lèi)胡蘿卜素、單寧等[20-21]。杜仲膠是異戊二烯的聚合物，含有大量共軛雙鍵，具有吸收紫外輻射的特性，膠滴在細(xì)胞核表面積累，能阻止紫外輻射進(jìn)入細(xì)胞核，從而保護(hù)DNA 分子免受紫外輻射損傷。

綜上，本研究證明杜仲葉片內(nèi)有非液泡化含膠細(xì)胞和液泡化含膠細(xì)胞，前者不含大液泡，僅為韌皮部較窄的薄壁細(xì)胞；后者含中央大液泡，包括韌皮部較大的薄壁細(xì)胞以及葉肉細(xì)胞和表皮細(xì)胞；膠滴內(nèi)部電子密度相對(duì)較低，表面電子密度相對(duì)較高；葉肉細(xì)胞內(nèi)尤其海綿細(xì)胞內(nèi)，膠滴傾向于聚集在細(xì)胞核表面。