張 科，王 杰，魏旭輝，劉中一

不可逆電穿孔（irreversible electroporation，IRE）消融，主要依賴高強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)瞬間釋放的電能而非焦耳熱，相對(duì)于冷、熱消融，一直被稱為非熱消融或常溫消融［1-2］。近年研究表明IRE 消融過(guò)程中，亦伴隨著一定的熱效應(yīng)，溫度變化主要取決于消融能量和組織散熱之間的平衡［3］。若IRE 前規(guī)劃和參數(shù)設(shè)置不當(dāng)，可能會(huì)對(duì)組織造成熱損傷，失去其消融特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。為了避免IRE 消融中的熱效應(yīng)，國(guó)外學(xué)者提出熱控電極和溫度閉環(huán)反饋算法的概念，并進(jìn)行體外細(xì)胞學(xué)和離體組織學(xué)初步實(shí)驗(yàn)［4-5］。本研究應(yīng)用熱控電極CT 導(dǎo)引經(jīng)皮肝穿刺對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行原位IRE 消融實(shí)驗(yàn)，并與傳統(tǒng)電極消融進(jìn)行比較，分析其技術(shù)特點(diǎn)、安全性和有效性。

1 材料與方法

1.1 高壓脈沖發(fā)生裝置和熱控電極構(gòu)建

高壓脈沖發(fā)生裝置和熱控電極，由中國(guó)電子科技集團(tuán)公司第14 研究所、南京臻泰微波科技有限公司自主研究開(kāi)發(fā)。高壓脈沖發(fā)生裝置可提供脈寬300 ns～2 ms、輸出電壓500 V～3 kV、電流最大80 A、頻率0.1～10 Hz 的電脈沖。熱控電極由兩根22 G空芯不銹鋼單極電極（暴露長(zhǎng)度5 mm）、特殊定制的絕緣型溫度傳感器、外部微控制器及溫度閉環(huán)反饋算法構(gòu)成。溫度傳感器探頭同軸置于空芯電極頭端內(nèi)部并實(shí)時(shí)采集消融中的溫度數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)反饋給微控制器，微控制器接受溫度閉環(huán)算法指令，循環(huán)比較消融中電極實(shí)時(shí)溫度是否超出設(shè)定的溫度閾值。本研究小鼠實(shí)驗(yàn)熱控電極反饋溫度設(shè)置為42℃。當(dāng)高于42℃時(shí)，微控制器控制高壓脈沖發(fā)生裝置停止釋放電脈沖，直至溫度低于42℃。傳統(tǒng)電極為兩根單極電極，為了便于和熱控電極的消融溫度進(jìn)行比較，對(duì)傳統(tǒng)電極也配置溫度采集功能，但沒(méi)有配備溫度控制功能。

1.2 計(jì)算機(jī)電場(chǎng)、溫度場(chǎng)仿真

參考相關(guān)文獻(xiàn)［6-7］，利用COMSOL Multiphysics多物理場(chǎng)仿真軟件進(jìn)行IRE 電場(chǎng)和溫度場(chǎng)仿真，粗略估計(jì)本實(shí)驗(yàn)所需要的電壓和場(chǎng)強(qiáng)參數(shù)，在以文獻(xiàn)報(bào)道的生物組織平均電導(dǎo)率0.4 s/m 條件下，得出消融電壓600 V、電極間距3.3 mm、場(chǎng)強(qiáng)1 800 V/cm，可獲得較為安全的小鼠肝臟IRE 有效電場(chǎng)覆蓋范圍（圖1①）?？紤]到本實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟的消融體積和范圍較小、散熱較慢，為簡(jiǎn)化運(yùn)算量，將總時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為2 ms（100 μs×20）進(jìn)行穩(wěn)態(tài)分析，模擬出脈寬100 μs、脈沖個(gè)數(shù)20 個(gè)條件下溫度上升接近15℃（圖1②）。

1.3 CT 導(dǎo)引下經(jīng)皮肝穿刺小鼠肝臟IRE 消融

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究獲南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批（IACUC-2007039）。18 只9～11 周齡美國(guó)癌癥研究所（ICR）小鼠，雌雄不限，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組9 只。實(shí)驗(yàn)組采用熱控電極進(jìn)行電場(chǎng)消融，對(duì)照組采用傳統(tǒng)電極消融。消融前實(shí)驗(yàn)鼠禁食4 h，腹腔注射麻醉，取仰臥位，消毒電極和術(shù)區(qū)，固定電極間距3.3 mm；沿劍突下向頭側(cè)穿刺肝中葉，進(jìn)針深度1 cm，CT 掃描驗(yàn)證穿刺成功后將電極連接脈沖發(fā)生裝置高壓輸出端，按照仿真參數(shù)條件釋放電壓600 V、脈寬100 μs、頻率1 Hz 脈沖20 個(gè)。計(jì)算機(jī)連接溫度傳感器和微控制器，記錄兩組消融時(shí)間和消融過(guò)程中電極溫度變化，觀察術(shù)中小鼠對(duì)脈沖的反應(yīng)，術(shù)后復(fù)蘇、進(jìn)食及體能恢復(fù)情況。

1.4 病理學(xué)評(píng)估

消融后30 h 處死所有小鼠，取肝臟大體標(biāo)本觀察、取材、固定、最大消融切面切片、蘇木精-伊紅（HE）染色和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色。采用ImageScope 病理掃描平臺(tái)進(jìn)行病理切片掃描，由2 名病理醫(yī)師閱片及病理學(xué)評(píng)估。有效IRE 消融標(biāo)準(zhǔn)：電極間肝細(xì)胞消融徹底無(wú)殘余、細(xì)胞凋亡、消融邊界呈細(xì)胞級(jí)過(guò)渡和消融區(qū)管腔結(jié)構(gòu)保留完好。同時(shí)計(jì)算兩組切片有效IRE 消融面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料比較用t 檢驗(yàn)，率的比較用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消融速率和消融溫度比較

雙通道示波器顯示兩組小鼠肝臟IRE 消融過(guò)程中每次脈沖輸出電壓穩(wěn)定，電流大小約8 A（圖2①）。消融起始時(shí)，兩組電極溫度曲線呈階梯狀上升，溫度隨每個(gè)脈沖釋放上升約0.5℃。實(shí)驗(yàn)組在第9～12 個(gè)脈沖區(qū)間內(nèi)觸發(fā)溫度閉環(huán)反饋程序，待溫度降至設(shè)定溫度閾值42℃以下時(shí)再次發(fā)放，使脈沖發(fā)放間隔延長(zhǎng)，釋放完20 個(gè)脈沖后消融總時(shí)長(zhǎng)（32.5±3.5） s，熱控電極溫度升高（5.3±0.8）℃；對(duì)照組接受20 個(gè)脈沖后消融總時(shí)長(zhǎng)（20.0±0） s，低于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），傳統(tǒng)電極溫度升高（18.6±4.3）℃，高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。以脈沖數(shù)目和所消耗時(shí)間對(duì)應(yīng)關(guān)系的脈沖-時(shí)間曲線反映消融速率，兩組消融速率見(jiàn)圖2②。兩組電極溫度隨脈沖釋放變化的脈沖-溫度趨勢(shì)見(jiàn)圖2③。

2.2 IRE 術(shù)中和術(shù)后情況

兩組經(jīng)皮肝穿刺成功率均為100%，未發(fā)生氣胸等穿刺并發(fā)癥。脈沖釋放時(shí)，所有小鼠出現(xiàn)與脈沖頻率相伴的肌肉收縮。術(shù)后兩組小鼠存活率均為100%，恢復(fù)良好，能正常進(jìn)食和活動(dòng)。

2.3 病理學(xué)對(duì)比

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各有2 只小鼠兩電極間存在殘余未完全消融的正常肝組織，視為無(wú)效消融；其余小鼠消融區(qū)肝組織HE 和TUNEL 染色均可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)消失、肝細(xì)胞凋亡、消融邊界呈細(xì)胞級(jí)過(guò)渡、消融區(qū)管腔結(jié)構(gòu)保留完好等典型IRE 病理表現(xiàn)（圖3①②），提示消融有效；實(shí)驗(yàn)組有效消融面積（15.2±3.6）mm2，小于對(duì)照組（21.3±5.2）mm2（P＜0.05）。有效IRE 消融切片中，對(duì)照組消融電極周圍存在不同程度細(xì)胞質(zhì)脫染情況，電極周圍區(qū)、消融中心區(qū)和消融邊緣區(qū)染色不均一（圖3③）；實(shí)驗(yàn)組消融中心區(qū)、邊緣區(qū)和電極周圍區(qū)HE 染色均勻，同質(zhì)性好（圖3④）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用熱控電極和傳統(tǒng)電極對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行IRE 電場(chǎng)消融，并從消融溫度、消融效率、消融特點(diǎn)、安全性和有效性等方面探討兩者區(qū)別。電極是產(chǎn)生IRE 脈沖電流回路的終端，電極溫度決定IRE 消融最高溫度。目前防止IRE 熱量產(chǎn)生的辦法主要有采取電流限制和采用熱控電極。本實(shí)驗(yàn)由于消融范圍較小，電流較低，電流波動(dòng)較小，不適宜采用電流限制方案。安吉戴尼克公司專利發(fā)明一種用于IRE 的灌注熱控電極，通過(guò)向電極內(nèi)主動(dòng)灌注冷卻液方式降低電極溫度，是一種主動(dòng)式熱控電極［8］。它不會(huì)延長(zhǎng)消融時(shí)間，但缺點(diǎn)是電極內(nèi)徑較大、工藝復(fù)雜、不適用于小病灶穿刺消融。本研究所用熱控電極結(jié)構(gòu)基于溫度傳感器和溫度閉環(huán)反饋算法，優(yōu)點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)單、體積小、成本低廉和便于實(shí)現(xiàn)，可在傳統(tǒng)電極基礎(chǔ)上加裝或定制，缺點(diǎn)是當(dāng)達(dá)到設(shè)定溫度反饋閾值，會(huì)增加脈沖間隔時(shí)間被動(dòng)等待組織降溫。結(jié)合本研究結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組脈沖數(shù)-時(shí)間曲線出現(xiàn)折點(diǎn)，提示熱控電極觸發(fā)溫度反饋，脈沖延遲發(fā)放，消融時(shí)間高于對(duì)照組，這表明消融速率較傳統(tǒng)電極低；對(duì)照組傳統(tǒng)電極因缺少溫度控制，脈沖-溫度曲線顯示溫度隨脈沖個(gè)數(shù)增加逐步上升，而熱控電極均能正常觸發(fā)溫度反饋，將電極溫度限制在溫度閾值附近，消融后溫度上升幅度顯著低于對(duì)照組。

相比于小鼠肝癌皮下移植瘤模型［9］和開(kāi)腹模型［10］IRE 實(shí)驗(yàn)，經(jīng)皮肝穿刺原位IRE 消融肝臟能夠反映電脈沖對(duì)靶器官和鄰近結(jié)構(gòu)的IRE 效應(yīng)和對(duì)全身安全的影響，也可排除因造瘤異質(zhì)性影響兩組電極的可比性；影像導(dǎo)引可提高靶區(qū)穿刺成功率，使電場(chǎng)不會(huì)波及非目標(biāo)區(qū)域［11］；同時(shí)得益于計(jì)算機(jī)仿真，能夠?qū)﹄妷?、電極間距和電場(chǎng)范圍參數(shù)進(jìn)行規(guī)劃［6］，保證電場(chǎng)最低有效范圍情況下把高壓電勢(shì)及其熱量對(duì)小鼠的威脅降到最低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后所有小鼠未出現(xiàn)穿刺相關(guān)并發(fā)癥，術(shù)后小鼠體能恢復(fù)良好，無(wú)死亡；說(shuō)明本方法安全、微創(chuàng)、簡(jiǎn)便，便于高通量研究。

IRE 消融不同于熱消融引起的即刻性熱凝固性壞死，主要引起細(xì)胞凋亡且具有滯后性，因此評(píng)估其病理學(xué)變化一般需要在脈沖電場(chǎng)施加后24 h 左右或之后進(jìn)行［12］。本實(shí)驗(yàn)病理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組消融有效性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，消融區(qū)均能觀察到典型的IRE 病理學(xué)變化，但實(shí)驗(yàn)組有效消融面積低于對(duì)照組。這個(gè)結(jié)果與Fesmire 等［5］報(bào)道的體外研究結(jié)果一致，說(shuō)明高壓脈沖電場(chǎng)產(chǎn)生過(guò)程中的熱量介導(dǎo)了IRE 的增強(qiáng)效應(yīng)。Ruarus 等［13］指出這種現(xiàn)象可能與溫度上升引起的組織電導(dǎo)率上升有關(guān)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照組電極溫度最高接近60℃，電極周圍消融區(qū)均存在細(xì)胞質(zhì)脫染現(xiàn)象，染色不如實(shí)驗(yàn)組均一。推測(cè)這種脫染現(xiàn)象是細(xì)胞穿孔后細(xì)胞內(nèi)蛋白等物質(zhì)失去了細(xì)胞膜的隔熱作用，部分未及時(shí)散失的熱量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，引起細(xì)胞內(nèi)水分丟失和細(xì)胞質(zhì)變性皺縮、脆硬脫落的緣故。本研究中熱控電極的消融效率（消融速率和消融范圍）不及傳統(tǒng)電極，正是因?yàn)閷?duì)照組細(xì)胞受到電場(chǎng)能量和部分轉(zhuǎn)化的焦耳熱量的雙重效應(yīng)，兩者具有協(xié)同效應(yīng)，導(dǎo)致消融末期效率增加和熱量驟增。然而熱控電極能夠限制電極最高溫度，通過(guò)達(dá)到閾值后主動(dòng)延長(zhǎng)脈沖間隔避免消融中熱量積累，雖然“犧牲”了消融效率，但也避免熱量對(duì)穿孔后細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的損傷。今后在IRE 新設(shè)備研究開(kāi)發(fā)、測(cè)試階段及進(jìn)行IRE 相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好能使用熱控電極對(duì)消融溫度進(jìn)行控制，以便排除熱效應(yīng)干擾，實(shí)現(xiàn)純粹“非熱”IRE，這樣得出的相關(guān)研究數(shù)據(jù)才更可信。

本研究表明在同等脈沖劑量下，傳統(tǒng)電極IRE在小鼠肝臟消融過(guò)程中比熱控電極產(chǎn)生更多熱量，熱控電極消融效率雖不及傳統(tǒng)電極，但能有效控制消融中的熱效應(yīng)，使消融更均一，實(shí)現(xiàn)真正意義上的非熱消融。如何在多消融參數(shù)變量下動(dòng)態(tài)控制IRE 消融過(guò)程熱量轉(zhuǎn)化與組織散熱間的平衡，使IRE 消融效率最大化，還有待于更進(jìn)一步研究。