萬顏凱，黃小華，麥秀章，曾憲明

1.東莞市企石醫(yī)院 病理科，廣東 東莞 523500；2.東莞市企石醫(yī)院 預(yù)檢分診，廣東 東莞 523500；3.東莞市企石醫(yī)院 客服中心，廣東 東莞 523500；4.東莞市企石醫(yī)院 外科，廣東 東莞 523500

0 引言

近些年來，甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)上升，雖然甲狀腺乳頭狀癌患者的預(yù)后大部分呈良好趨勢，死亡率較低，但臨床隨訪資料也發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)屬于患者惡性進(jìn)展的危險因素，一旦患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)的情況，其惡性程度明顯增高，患者死亡率也隨之上升[1-2]。因此，探尋有價值的甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)后評估分子指標(biāo)和分子治療靶點對早期預(yù)測患者預(yù)后和及時干預(yù)具有重要臨床價值。本研究采用siRNA技術(shù)下調(diào)人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞株中DJ-1蛋白表達(dá)，進(jìn)而觀察細(xì)胞的遷移和侵襲行為變化情況，初步分析DJ-1基因調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞發(fā)生遷移及侵襲行為的可能發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞株，DJ-1 siRNA 正義鏈序列：正義鏈序列5′-GCUCUGU UGGCUCAUGAAATT-3′，由上海吉瑪公司合成，非特異隨機序列由上海吉瑪公司贈送，Scramble 正義鏈序列：5′-UUCUCC GAACGUG UCACGUTT-3′。RPMI-1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清購自美國Hyclone公司，脂質(zhì)體lipofectamine TM 2000購自美國Invitrogen公司。BCA法蛋白定量測定試劑盒海門碧云天生物技術(shù)公司。Transwell實驗所用的小室購自Corning。Matrigel matrix購自BD。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中對人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2飽和濕度。

1.2.2 實驗分組和轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染分3個組：空白對照組：對人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞不做任何處理。轉(zhuǎn)染非特異性對照組：對細(xì)胞轉(zhuǎn)染Scramble RNA 20nmol/L，并加入適量Lipofect 2000TM；轉(zhuǎn)染si DJ-1組對細(xì)胞轉(zhuǎn)染DJ-1 siRNA 20nmol/L，并加入適量Lipofect 2000TM。各組實驗細(xì)胞均孵育20min（室溫條件），然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板中，24h后即可收集細(xì)胞。

1.2.3 Western印跡法（WB）

應(yīng)用WB法檢測各組實驗細(xì)胞中DJ-1蛋白表達(dá)情況。收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，讓細(xì)胞得到充分裂解后進(jìn)行總蛋白提取，提取后進(jìn)行BCA法蛋白定量測定蛋白含量，然后進(jìn)行WB檢測。

1.2.4 細(xì)胞遷移和侵襲行為觀察實驗

（1）細(xì)胞遷移實驗操作過程：在遷移小室中加入各組細(xì)胞懸液，注意遷移小室濾膜是沒有細(xì)胞外基質(zhì)膠，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，將遷移小室拿出，倒棄內(nèi)部的培養(yǎng)液，采用棉簽將表面沒有遷移的殘留細(xì)胞輕輕擦拭，并將小室濾膜下表面的細(xì)胞立即采用無水乙醇固定，然后加入結(jié)晶紫染色。對染色后的細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡下觀察，隨機五個視野（×100）觀察細(xì)胞并計數(shù)，計算平均值。

（2）細(xì)胞實驗操作過程：首先進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)膠的配置，按照6.7%的比例，在Transwell小室內(nèi)加入20μl含MatrigelTM的培養(yǎng)液，使Transwell小室濾膜表面形成一層細(xì)胞外基質(zhì)膠。在Transwell小室中加入各組細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)36h后，將Transwell小室拿出，倒棄內(nèi)部的培養(yǎng)液，采用棉簽將表面未穿過聚碳酯膜小孔的殘留細(xì)胞及表面細(xì)胞外基質(zhì)膠輕輕擦拭，立即采用無水乙醇固定穿過小孔細(xì)胞，然后加入結(jié)晶紫染色。顯微鏡下（×100）隨機五個視野觀察細(xì)胞并計數(shù)，取其平均值作圖分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組DJ-1蛋白的表達(dá)水平比較

轉(zhuǎn)染si DJ-1組DJ-1蛋白的相對表達(dá)量明顯較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性對照組減弱（P＜0.05），而后兩者之間比較，DJ-1蛋白相對表達(dá)量相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。表明轉(zhuǎn)染si RNA后，人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞株中DJ-1蛋白表達(dá)水平明顯受到了抑制。

2.2 DJ-1-siRNA對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞株體外遷移力和侵襲力的影響

在細(xì)胞遷移和侵襲實驗中，轉(zhuǎn)染si DJ-1組中遷移穿膜和侵襲穿膜的細(xì)胞數(shù)量均明顯少于空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性對照組（t遷移=4.494，4.481，t侵襲=4.039，3.594，P＜0.05），而后兩者之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.068，2.141，P＞0.05），見表1和圖2、圖3。說明沉默DJ-1表達(dá)后，甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞株的運動能力和侵襲能力明顯受到抑制。

表1 DJ-1-siRNA 對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細(xì)胞株體外遷移力和侵襲力的影響

3 討論

盡管大部分甲狀腺乳頭狀癌的惡性潛能相對不高，病例的預(yù)后尚佳，患者10年生存率有95%以上，但臨床會遇到一些發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的病例，其預(yù)后不佳，死亡率明顯增高[3]。目前，甲狀腺癌的分子生物靶向治療受到美國甲狀腺協(xié)會和美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)的推薦，能讓患者獲得更有利的治療方案。因此，探明甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的具體調(diào)控機制，尋找有價值的甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)后評估分子指標(biāo)和分子治療靶點成為近年來的研究熱點[4-5]。

近年來，國內(nèi)外較多文獻(xiàn)對DJ-1基因參與惡性腫瘤發(fā)生和惡性演進(jìn)的作用機制進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DJ-1的細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激等調(diào)控功能在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能起重要作用[6-9]。目前，在甲狀腺癌中DJ-1 基因表達(dá)情況相關(guān)研究報道不多，且仍存在爭議，國內(nèi)李海研究[10]檢測到 DJ-1在甲狀腺癌組織中出現(xiàn)高表達(dá)，推測其應(yīng)與甲狀腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，但沒有發(fā)現(xiàn)DJ-1高表達(dá)與甲狀腺癌預(yù)后有相關(guān)性；而國內(nèi)酈秀芳[11]相關(guān)研究卻發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌的發(fā)生、浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性臨床特征與DJ-1過表達(dá)密切相關(guān)。本研究前期結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中存在DJ-1特異性高表達(dá)，且伴有DJ-1高表達(dá)的病例出現(xiàn)更強的浸潤和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。

在此研究基礎(chǔ)上，本研究設(shè)計了DJ-1基的siRNA序列，并轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株進(jìn)一步沉默DJ-1表達(dá)，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過si DJ-1轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中DJ-1蛋白受到明顯抑制，相對表達(dá)明顯較其他兩對照組減弱（P＜0.05），說明經(jīng)過轉(zhuǎn)染si RNA后，沉默了甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中DJ-1蛋白表達(dá)。進(jìn)一步體外觀察si RNA DJ-1轉(zhuǎn)染對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲行為的影響，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)生遷移穿膜細(xì)胞數(shù)和侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)均出現(xiàn)顯著減少，說明轉(zhuǎn)染siRNA后，沉默了DJ-1表達(dá)，抑制DJ-1表達(dá)后，隨之該基因涉及的一系列調(diào)控作用也被抑制，進(jìn)而對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的遷移和侵襲行為起到了一定抑制作用，提示了DJ-1可能與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，DJ-1高表達(dá)將調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲行為，通過以后更為深入的相關(guān)機制研究，了解DJ-1的分子調(diào)控機制，將有望為甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移者的分子靶向治療提供新靶點和研究方向。