林中源，張金三

1.溫州大學 生命與環(huán)境科學學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科/浙江省介入肺臟病學重點實驗室，浙江 溫州 325000；3.浙江省生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 溫州 325035

0 引言

泛素化是一種廣泛存在并且嚴格調(diào)控的蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post-translational modifications,PTMs），是控制細胞內(nèi)底物蛋白最終命運的最重要機制。泛素化過程包括三個關鍵步驟以及三類關鍵蛋白的參與，包括泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）[1]。首先，E1通過消耗ATP來激活泛素（ubiquitin，Ub）；其次，E1將激活的泛素分子轉(zhuǎn)移至E2；最后，E2同時攜帶E3以及激活形式的泛素識別靶蛋白，進一步進行泛素化修飾過程[2]。因為底物蛋白的特異性是由E3決定的，所以E3在整個泛素化過程中發(fā)揮著關鍵作用[3]。此外，識別、降解、亞細胞定位以及組裝成底物蛋白的功能復合物都是由泛素鏈決定的。泛素化還分為單泛素化和多泛素化兩種，單泛素化即一個Ub分子連接到靶蛋白一個或幾個的賴氨酸殘基上，一般發(fā)生在信號轉(zhuǎn)導和囊泡分類等途徑；然而，多泛素化即Ub分子鏈連接到靶蛋白的賴氨酸殘基上，這種過程主要發(fā)生在蛋白質(zhì)降解中。

去泛素化（DUBs）本質(zhì)上為水解反應的去泛素化過程，DUBs將泛素分子從目標蛋白底物上分割下來，進而調(diào)控泛素連接酶的活性。泛素化-去泛素化途徑共同調(diào)節(jié)多種細胞功能，包括蛋白質(zhì)降解（蛋白酶體和溶酶體）、凋亡、細胞存活、細胞周期進程、染色體分離以及基因表達等[4]。DUBs屬于蛋白酶超家族，其中按催化機制分為五類：天冬氨酸、金屬、絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸蛋白酶[5]。DUBs大多數(shù)為半胱氨酸蛋白酶，他們與Ub進行共價結(jié)合；少數(shù)為金屬蛋白酶，可以與Ub形成非共價鍵[6]。按照催化結(jié)構(gòu)域進行分類還可以將他們分為以下七個家族：泛素特異性蛋白酶家族（USPs)、泛素C末端水解酶家族（ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs）、卵巢腫瘤蛋白酶家族（ovarian tumorrelated proteases，OTUs）、Machado-Josephin蛋白酶家族（Machado-Josephin disease protein domain proteases，MJDs）、Jab 1/MPN域相關金屬異肽酶（Jab1/MPN domain associated metalloisopeptidase，JAMMs）和單核細胞趨化蛋白誘導蛋白家族（monocyte chemotactic proteininduced protein，MCPIP）[7]，以及最近發(fā)現(xiàn)的鋅指含泛素肽酶1(zinc finger containing ubiquitin peptidase 1，ZUP1)[8]。在人類基因組中編碼DUBs約100種，其中USPs含有超過50種[9]，這原因在于E3的數(shù)量在進化過程中增加，USP的數(shù)量也隨之增加，這表明兩者之間的密切關系導致了它們的共同進化[10]。USP10作為USP蛋白酶家族中的一員，其被報道特異性識別的底物已經(jīng)超過20種，在人類的多種疾病中發(fā)揮重要作用。我們總結(jié)了USP10底物的相關信號通路來預測USP10在肺發(fā)育過程以及在肺疾病中的潛在影響。

1 USP10的結(jié)構(gòu)特征

人源USP10基因位于染色體16q24.1，包含19個外顯子，其mRNA編碼的蛋白含有798個氨基酸，在進化過程中高度保守。USP10的亞細胞定位廣泛，幾乎表達于所有細胞的胞核及胞漿中（NCBI Gene:9100）。我們將氨基酸序列在PTMcode數(shù)據(jù)庫中進行分析時發(fā)現(xiàn)USP10有51個潛在的轉(zhuǎn)錄后修飾位點，包括47個磷酸化位點和4個泛素化位點（圖1A）。在DNA損傷時，ATM磷酸化USP10的Thr42及Ser337位點，使得部分USP10入核并與P53相互作用調(diào)節(jié)其泛素化水平[11]。此外，我們通過Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)USP10含有兩個結(jié)構(gòu)域，分別是ataxin-2c和泛素特異性蛋白酶結(jié)構(gòu)域（USP）（圖1B）。

（圖1A）USP10的51個潛在的翻譯后修飾位點，每個矩形代表一個氨基酸，其中藍色矩形為磷酸化位點，綠色矩形為泛素化位點，紅色矩形為被ATM磷酸化的位點。（圖1B）USP10含有一個ataxin-2 C-terminal域，一個USP域，一個P53結(jié)合位點以及兩個PPXY基序。

2 USP10與肺發(fā)育

依據(jù)關鍵的形態(tài)轉(zhuǎn)變肺發(fā)育過程可分為五個階段：胚胎期、假腺期、小管期、終末囊泡期和肺泡期。在這期間肺經(jīng)歷了肺芽發(fā)生、細胞命運確定、分支形態(tài)發(fā)生、囊泡發(fā)育以及肺泡發(fā)育[12]。這一過程涉及細胞分子轉(zhuǎn)導、細胞增殖、細胞分化以及多條相關信號通路的參與如音猬因子（Sonic hedgehog，SHH）[13]，Hippo[14]，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)[15]，成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）[16-17]等。這些信號通路如何穩(wěn)定行使功能還有待進一步挖掘。近幾年的報道中發(fā)現(xiàn)USP10除了調(diào)控包括P53[11],NF-B[18]，SIRT6[19]等蛋白穩(wěn)定性外，還有部分底物直接影響上述參與肺臟發(fā)育信號通路并有可能對肺臟發(fā)育存在直接影響。

2.1 USP10與Hippo通路

Hippo信號通路除參與了細胞命運決定、干細胞調(diào)節(jié)、再生、免疫、腫瘤發(fā)生之外，還在發(fā)育過程中參與調(diào)節(jié)器官大小[14]。Yes相關蛋白（Yes associated protein,YAP）與帶有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）是Hippo通路中一對關鍵的下游效應因子[20]。TAZ KO小鼠會導致肺泡呈肺氣腫樣間隔變大、肺泡腔簡化的發(fā)育異常，這非常類似于COPD的病癥表現(xiàn)[21]。Morin-Kensicki等研究顯示YAP KO會導致小鼠胚胎死亡[22]；最近的報道也發(fā)現(xiàn)特異性敲除Shh譜系中YAP會導致器官形態(tài)發(fā)生異常[21]。因此，YAP/TAZ及其調(diào)節(jié)因子被認為是肺發(fā)育異常的重要因素。YAP/TAZ的蛋白水平及功能主要通過磷酸化和泛素化等蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控。大腫瘤抑制激酶（large tumor suppressor homologue 1/2，Lats1/2）誘導YAP Ser381處發(fā)生磷酸化，抑制YAP/TAZ的轉(zhuǎn)錄活性，隨后招募E3泛素連接酶SCFβ-TRCP和泛素介導YAP降解[23]。USP10能夠抑制SCFβ-TRCP和泛素參與的YAP/TAZ降解過程，逆轉(zhuǎn)YAP/TAZ的泛素化水平，從而調(diào)控YAP/TAZ豐度[24]。近期Danielle R.Little團隊發(fā)現(xiàn)在肺臟發(fā)育過程中，YAP/TAZ的缺失會影響NKX2.1與肺泡一型細胞（alveolar type 1，AT1）譜系特異性位點結(jié)合，從而影響AT1、AT2譜系的分化。這意味著USP10很有可能通過調(diào)節(jié)YAP/TAZ的穩(wěn)定性，對肺泡上皮譜系的正常發(fā)育有重要意義，表明USP10對肺發(fā)育異?？赡芫哂袧撛诘谋Ｗo作用[25]。YAP從結(jié)構(gòu)上主要分為兩種剪切異構(gòu)體，只含有一個WW結(jié)構(gòu)域的一型YAP以及含有兩個WW結(jié)構(gòu)域的二型YAP，且與YAP互作的蛋白均含有PPXY基序[26]，我們在NCBI中尋找USP10的序列時發(fā)現(xiàn)USP10也含有兩個PPXY基序（圖 1B）。目前這兩個結(jié)構(gòu)域的存在是否和USP10與YAP的互作有關還不得而知。這表明USP10對YAP活性調(diào)節(jié)能力可能與YAP本身的亞型有關，并且預示著USP10與肺臟發(fā)育也存在著密切關系。

2.2 USP10與自噬

自噬的溶酶體降解途徑在細胞，組織，機體穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮著重要作用[27]。參與自噬通路中多種重要蛋白的水平與多種人類疾病相關如：炎癥疾病，癌癥以及神經(jīng)退行性疾病等。USP10在近些年中也發(fā)現(xiàn)了幾種影響自噬通路的特異性底物如：Beclin1、P62、LC3B等。USP10與USP13可通過影響B(tài)eclin1的泛素化水平影響B(tài)eclin1的穩(wěn)定，進一步影響B(tài)eclin1參與的Vsp34復合體的功能。Beclin1亦可以轉(zhuǎn)而影響USP10以及USP13的去泛素化活性從而影響P53蛋白水平[28]。但，USP10在肺發(fā)育假腺期的其他潛在功能目前還沒有被探索和重視。肺發(fā)育過程中存在兩個自噬高峰期：①E12.5；②E16.5～E18.5[29]。妊娠早期（E10.5）和妊娠晚期（E16.5）條件性敲除肺上皮細胞中Beclin1的表達會分別導致分支形成和球囊形成的減少、遠端上皮分化延遲等表型[29]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），作為自噬過程中細胞能量感知以及參與細胞信號調(diào)控的重要激酶之一，在能量應激過程中人類肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）參與的AMPK磷酸化過程會因其自身的泛素化水平而受到抑制。去泛素化酶USP10可以特異性去除AMPK的泛素化，并促進LKB1磷酸化AMPK過程。能量應急時，磷酸化AMPK會磷酸化UPS10的Ser76，這使USP10對AMPK的磷酸化活性增強。USP10-AMPK正反饋環(huán)促進了細胞能量波動的調(diào)節(jié)作用[30]。因此，探究USP10在肺臟發(fā)育過程中對自噬的影響有望為臨床上因自噬異常引起的肺發(fā)育異常設計靶向藥物提供新思路。

3 USP10與肺癌

肺癌是全世界范圍內(nèi)最常見的癌癥相關死亡的主要原因之一[31]。肺癌主要分為兩種類別，即非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）包括肺腺癌、鱗癌和大細胞癌與小細胞肺癌。目前肺癌是以手術(shù)切除、化療為主要的治療方法。由于其復發(fā)率高并且對于許多化療藥物具有耐藥性[32]，因此，進一步了解肺癌發(fā)病機制，尋找肺癌致病靶點，開發(fā)新的肺癌靶向藥物迫在眉睫。近幾年關于USP10的報道中表明，USP10在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的作用。

3.1 USP10-P53與肺癌的潛在關系

P53作為腫瘤抑制因子中重要的成員之一，可參與調(diào)控數(shù)百種基因，這些基因又參與了多種生物學活動，包括DNA損傷，細胞周期阻滯，衰老以及凋亡。在正常情況下，USP7（HAUSP）在細胞核中可直接去泛素化P53或間接的通過影響鼠雙微體基因2（murine double minute 2，MDM2）來調(diào)節(jié)P53蛋白的泛素化水平。核外的P53會由USP10直接去泛素化來穩(wěn)定P53。在致癌信號刺激時，部分USP10由ATM磷酸化Thr42與Ser337后入核發(fā)揮功能穩(wěn)定P53[11]。有趣的是，USP10并不能像USP7那樣通過影響MDM2調(diào)控P53水平。最新研究發(fā)現(xiàn)，在致癌信號刺激條件下USP10可以通過去泛素化和穩(wěn)定p14ARF，隨后p14ARF通過與MDM2的互作來調(diào)節(jié)P53的水平[33]。并且在作者發(fā)現(xiàn)的C-myc/p14ARF/P53通路中，C-myc可以通過與USP10的第二個啟動子的結(jié)合，調(diào)控USP10的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)控p14ARF與下游P53水平。但在非小細胞肺癌中C-myc上調(diào)、USP10成正常水平、p14ARF下調(diào)。因此，C-myc/USP10/p14ARF通路在非小細胞肺癌中的重要作用，預示著治療腫瘤的潛在靶點。此外，在肺癌中USP10還可以通過直接與PTEN的相互作用來發(fā)揮腫瘤的抑制作用[34]。最新的研究表明，真核翻譯起始因子γ1（eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1，EIF4G1）在NSCLC細胞系中高表達，促進NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲，同時作者還發(fā)現(xiàn)其與USP10有直接相互作用，并且USP10作為EIF4G1的負調(diào)控因子可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[35]。上述研究提示USP10/EIF4G1/P53相關機制的重要性，這可能是NSCLC類癌癥的新型治療靶點。與USP10互作的另一種底物—胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白3（Insulinlike growth factor 2 mRNA-binding protein 3，IGF2BP3）也與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關[36]。IGF2BP3 mRNA與蛋白水平主要在肺鱗癌與肺腺癌中呈高水平趨勢，并且IGF2BP3的C端KH域可與USP10相互作用，通過降低USP10對P53蛋白的去泛素化活性，使P53蛋白水平和半衰期持續(xù)下降，促進腫瘤在肺部的發(fā)生、增殖和侵襲。因此，針對IGF2BP3/USP10/P53通路進行靶向藥物的開發(fā)很有可能是肺癌的另一種治療途徑。

3.2 USP10-HDAC6與肺癌的潛在關系

HDAC6屬于IIb級HDAC家族[37]，可參與多種蛋白的去乙酰化，包括Hsp90[38]，MSH2[39]等。HDAC6脫乙酰酶活性的失調(diào)和HDAC6的過度表達都與癌癥發(fā)生和順鉑耐藥有關[40-41]。并且在有P53突變的NSCLC中USP10高表達，這些研究結(jié)果表明針對USP10抑制劑的開發(fā)或許能夠找到USP10-HDAC6-順鉑耐藥性軸的突破口。除具有去乙?；钚裕琀DAC6對于MSH2蛋白表現(xiàn)出E3活性，通過降低MSH2的蛋白水平使增敏正常細胞對DNA損傷。但是有趣的是，USP10不但能去泛素化穩(wěn)定MSH2[42]，還可以直接去泛素和穩(wěn)定組蛋白去乙?；?（HDAC6）[43]。因此，USP10去泛素化穩(wěn)定HDAC6以及MSH2的貢獻程度似乎影響了肺癌發(fā)生。雖然HDAC6在NSCLC中的作用已經(jīng)得到初步結(jié)論，但是HDAC6/USP10/MSH2的平衡關系在NSCLC中的作用還有待進一步探索?？傊?，USP10底物的多樣性，導致其在肺癌中的作用錯綜復雜，相關的作用機制還需進一步驗證。

4 USP10與肺纖維化

肺纖維化是一種慢性、不可逆和致命的間質(zhì)性肺疾病，嚴重威脅人類健康。肺部疾病及肺纖維化的發(fā)病率隨著人口老齡化而增加。最常見的肺纖維化類型是IPF，其中位生存期只有2～4年[44-45]。迄今，肺纖維化的發(fā)病機制仍不明確，并且沒有有效的治療藥物。因此，闡明肺纖維化的發(fā)病機制和開發(fā)有效的治療藥物非常重要。目前公認的肺纖維化發(fā)生發(fā)展歸因于成纖維細胞病灶的形成，如肺上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、間充質(zhì)細胞的增殖和周期性成纖維細胞的募集，最終導致膠原蛋白的大量沉積，從而影響肺組織正常結(jié)構(gòu)與功能[46]。USP10的下游底物分析表明，USP10在肺纖維化相關疾病中可能發(fā)揮關鍵作用。

4.1 去泛素化功能與肺纖維化

瘢痕和纖維化疾病的表征之一為整合素β1與β5在細胞膜表面豐度累計，從而導致TGFβ通路的進一步激活，及纖維化標志物，如α-sma等的表達。雖然還沒有USP10直接影響肺纖維化的報道，但最新的研究發(fā)現(xiàn)整合素β1是USP10的底物蛋白[47]，并且在過去的研究中發(fā)現(xiàn)整合素β1于上皮位置的特異性缺失會嚴重影響假腺期肺上皮的初級分支[48]。提示USP10在肺纖維化以及肺發(fā)育中的潛在作用。此外USP10還與肺癌和肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的EMT通路密切相關。例如EMT進程中Snail2，Smad4，Slug的蛋白穩(wěn)定性均與USP10豐度成正相關，即USP10可以通過去泛素化作用抑制上述蛋白的蛋白酶體降解途徑[49-50]，預示USP10的過表達或敲低在肺癌、肺纖維化以及肺發(fā)育中會促進或抑制EMT演進過程。

4.2 非去泛素化功能與肺纖維化

除了USP 域可能參與肺纖維化進程外，USP10去泛素化蛋白域也與CF有潛在聯(lián)系。在各種應激情況下，如氧化應激，會產(chǎn)生高細胞毒性的泛素化蛋白，泛素化蛋白增加會導致細胞毒性，并且隨著年齡的增加這種泛素化蛋白的累積量會因為蛋白酶體途徑活性受損而逐漸增加。機體為減輕這種泛素化蛋白的大量累積所導致的細胞毒性，通過USP10與P62共同介導促進泛素化蛋白向泛素化蛋白聚集體的轉(zhuǎn)變[51]。越來越多的證據(jù)顯示，泛素化蛋白聚集體的細胞毒性較泛素化蛋白低，這也是退行性疾病的產(chǎn)生的主要原因之一，如肺囊性纖維化（CPF）。囊性纖維化跨膜電導調(diào)節(jié)因子（CFTR）-△F508是在CPF中最典型的易聚集蛋白。USP10的N端和C端均能與泛素受體P62蛋白結(jié)合促進（CFTR）-△F508泛素化聚集體形成來降低蛋白質(zhì)低聚物的數(shù)量以降低細胞毒性，進而抑制細胞凋亡。有趣的是，雖然C端參與了互作以及后續(xù)的調(diào)控過程，這種調(diào)控并不是通過去泛素化功能來實現(xiàn)的[52]。以上研究表明USP10除了通過底物去泛素化發(fā)揮作用，尚有非泛素化依賴的機制有待進一步挖掘。

5 結(jié)論與展望

近年的研究不斷地刷新我們對USP10功能和機制的認知。本文重點總結(jié)，并進一步推測USP10在肺臟發(fā)育、腫瘤以及肺纖維化過程中的作用及相關機制。迄今，盡管大部分USP10的研究局限于體外細胞實驗，但已有應用USP10敲除鼠在肝臟和心臟相關研究報道[53-54]。相關模型也將有助于闡明USP10在肺發(fā)育的作用和相關機制，如初期支氣管形成，末期肺泡發(fā)生與成熟等。另外還可以將其結(jié)合COPD、IPF和腫瘤模型探究USP10在肺部炎癥、纖維化及癌癥中的作用及機制。雖然USP10在肺臟發(fā)育及疾病的分子機制尚不清晰，但隨著USP10研究的不斷深入，更多功能以及相關機制將會逐漸被闡明。以USP10為靶點將有望為肺發(fā)育疾病及成年肺疾病挖掘新的治療策略，為臨床攻克肺臟疾病提供新思路。