趙 誠， 解 龍， 徐巾嵐

(上海化工研究院有限公司/上海市穩(wěn)定同位素檢測及應(yīng)用研發(fā)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái) 上海 200062)

氮元素是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一，是構(gòu)成植物蛋白質(zhì)的重要成分，在多個(gè)方面直接或間接影響植物的代謝活動(dòng)和生長發(fā)育[1-2]。隨著近年來農(nóng)業(yè)氮遷移轉(zhuǎn)化過程等研究領(lǐng)域的發(fā)展，15N標(biāo)記示蹤技術(shù)在生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)研究中發(fā)揮了重要作用。15N標(biāo)記示蹤技術(shù)是將一定數(shù)量的15N標(biāo)記示蹤劑(如15N標(biāo)記尿素)添加到生態(tài)系統(tǒng)(植物、土壤或整個(gè)生態(tài)系統(tǒng))中，經(jīng)過一段時(shí)間后分析其去向[3-5]。在生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)研究方面，15N標(biāo)記示蹤技術(shù)不受穩(wěn)定同位素分餾效應(yīng)的影響，具有15N自然豐度法和傳統(tǒng)示蹤法所不具備的優(yōu)點(diǎn)。15N標(biāo)記尿素作為15N標(biāo)記示蹤劑在農(nóng)業(yè)科學(xué)中的應(yīng)用研究十分廣泛，已應(yīng)用于陸地生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)尺度上的各個(gè)方面，如分析氮的來源、分配[6]、利用率和去向[7-8]、轉(zhuǎn)化以及損失等[9-11]，從而能夠加深對(duì)生態(tài)系統(tǒng)尺度上氮循環(huán)的認(rèn)識(shí)和提升氮管理的能力。在這些前沿基礎(chǔ)科學(xué)研究的過程中，15N肥料利用率、15N損失率、15N殘留率和15N氮肥分配率等，均與15N標(biāo)記示蹤劑的同位素豐度直接相關(guān)，因此，15N標(biāo)記尿素同位素豐度的準(zhǔn)確測定顯得尤為重要。

現(xiàn)有的15N標(biāo)記尿素同位素豐度檢測方法主要有氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜法[12]、中紅外光譜法[13]、氣體同位素質(zhì)譜法[14-15]等。15N同位素豐度范圍0.365%～99%的15N標(biāo)記尿素均可以作為示蹤劑，氣體同位素質(zhì)譜法在該范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確測定15N同位素豐度，因此，氣體同位素質(zhì)譜法是目前主要的檢測方法。

氣體同位素質(zhì)譜法現(xiàn)有的前處理方法有消化法-次溴酸鹽氧化聯(lián)用法和微量高溫燃燒法。消化法-次溴酸鹽氧化聯(lián)用法是在濃硫酸和接觸劑的作用下，先將15N標(biāo)記尿素消解生成15N標(biāo)記銨鹽，然后在堿性條件下通過凱氏定氮儀蒸餾出15N標(biāo)記氨水，再用酸吸收得到15N標(biāo)記銨鹽，濃縮后用次溴酸鈉轉(zhuǎn)化為15N標(biāo)記氮?dú)?，整個(gè)前處理過程耗時(shí)約5 h，樣品消耗量在100 mg以上。微量高溫燃燒法是將15N標(biāo)記尿素樣品中的氮元素高溫氧化為氮氧化物，氮氧化物經(jīng)過銅絲還原生成15N標(biāo)記氮?dú)?，整個(gè)前處理過程耗時(shí)約6 h，樣品消耗量在10 mg左右。上述2種前處理過程耗時(shí)均較長，因此開發(fā)一種快速的、測試結(jié)果準(zhǔn)確的15N標(biāo)記尿素同位素豐度檢測方法顯得尤為重要。

脲酶催化尿素測定含量的方法已經(jīng)比較成熟[16-18]，但用于15N標(biāo)記尿素同位素豐度的測定卻未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究主要對(duì)脲酶催化反應(yīng)時(shí)間、銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間和溫度等參數(shù)進(jìn)行了考察，并就酶催化法與微量高溫燃燒法(相比消化法-次溴酸鹽氧化聯(lián)用法樣品消耗量少)測定15N同位素豐度的結(jié)果、方法精密度、準(zhǔn)確度等進(jìn)行了對(duì)比，初步建立了基于酶催化反應(yīng)測定15N標(biāo)記尿素同位素豐度的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

MAT-271型氣體同位素質(zhì)譜儀，美國Finnigan質(zhì)譜公司；DF-101Z型智能集熱式恒溫磁力攪拌器，上海衛(wèi)凱儀器設(shè)備有限公司；SX2-4-10型箱式電阻爐，上海實(shí)研電爐有限公司。

15N標(biāo)記尿素，15N同位素豐度分別為5.10%、10.15%、60.18%、98.14%、99.18%，純度均≥98.5%，上?；ぱ芯吭河邢薰荆浑迕?，約1 U/mg，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；塊狀氧化鈣，分析純(AR)，上海麥克林生化科技有限公司；溴、氫氧化鈉、線狀氧化銅、溴甲酚綠指示劑、甲基紅、乙醇均為AR，分子篩(5A)、銅絲(純度99.9%)、尿素(AR，15N同位素天然豐度為0.365%)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸，AR，江蘇強(qiáng)盛化工有限公司。

1.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源；法拉第杯；電子能量100 eV；離子源溫度129 ℃；高壓9.8 kV；質(zhì)荷比28～45。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微量高溫燃燒法

(1)反應(yīng)原理

在真空、高溫條件下，氧化銅分解釋放氧氣，氧氣將15N標(biāo)記尿素樣品中的氮元素氧化為氮氧化物，氮氧化物經(jīng)銅絲還原生成15N標(biāo)記氮?dú)鈁14]，將15N標(biāo)記氮?dú)庖霘怏w同位素質(zhì)譜儀中檢測質(zhì)荷比為28、29和30的離子流強(qiáng)度，并根據(jù)不同豐度范圍計(jì)算15N同位素豐度。

(2)樣品前處理

將塊狀氧化鈣、分子篩分別破碎后過0.85 mm(20目)篩。將氧化鈣、分子篩、線狀氧化銅放在馬弗爐中520 ℃干燥2～4 h，于100 ℃ 下干燥玻璃反應(yīng)管2～4 h。5～10 mg15N標(biāo)記尿素樣品、20～30 mg線狀氧化銅、4根1～2 cm長的銅絲、20～30 mg氧化鈣、4～8粒分子篩加入玻璃反應(yīng)管[見圖1(a)]中。通過真空橡膠管將玻璃反應(yīng)管的“1”連接抽真空系統(tǒng)，待真空度低于50 Pa時(shí)，使用丁烷噴槍將玻璃反應(yīng)管的“2”熔封[19]。熔封后的玻璃反應(yīng)管放入箱式電阻爐中在520 ℃下反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，玻璃反應(yīng)管放入進(jìn)樣管[見圖1(b)]中，進(jìn)樣管的“3”連接氣體同位素質(zhì)譜儀，抽真空，待真空度達(dá)到儀器要求后，通過旋轉(zhuǎn)“5”將反應(yīng)管易碎處折斷并釋放氣體，將氣體引入氣體同位素質(zhì)譜儀中檢測質(zhì)荷比為28、29和30的離子流強(qiáng)度。

1.連接抽真空系統(tǒng)；2.丁烷噴槍熔封位置；3.連接氣體同位素質(zhì)譜儀接口；4.熔封后的反應(yīng)管易碎處；5.通過旋轉(zhuǎn)將反應(yīng)管易碎處折斷并釋放氣體；6、7.連接密封

1.3.2 脲酶催化法

(1)反應(yīng)原理

脲酶催化法反應(yīng)分為三步：第一步，酶具有非常高的專一性，15N標(biāo)記尿素在脲酶溶液的存在下催化轉(zhuǎn)化生成15N標(biāo)記碳酸銨，即反應(yīng)方程式(1)；第二步，15N標(biāo)記碳酸銨在堿性、65 ℃條件下分解產(chǎn)生15N標(biāo)記氨氣，酸吸收15N標(biāo)記氨氣生成15N標(biāo)記銨鹽，即反應(yīng)方程式(2)和(3)；第三步，15N標(biāo)記銨鹽與次溴酸鈉反應(yīng)生成15N標(biāo)記氮?dú)?，即反?yīng)方程式(4)。通過酶催化反應(yīng)得到的15N標(biāo)記氮?dú)庖霘怏w同位素質(zhì)譜儀中，檢測質(zhì)荷比為28和29的離子流強(qiáng)度，并計(jì)算15N同位素豐度。

(3)

(4)

(2)樣品前處理

脲酶催化法反應(yīng)分為三步，故前處理也分為三步：第一步，取10～15 mg15N標(biāo)記尿素、50 mg脲酶加入銨鹽吸收裝置(見圖2)的50 mL燒杯中，加2 mL 4 mol/L硫酸溶液于10 mL燒杯中，加5 mL蒸餾水于50 mL燒杯中，2只燒杯中分別加入幾滴溴甲酚綠-甲基紅指示劑，用封口膜將50 mL燒杯封口，在40 ℃條件下酶催化反應(yīng)10 min；第二步，打開封口膜，加2 mL 10 mol/L氫氧化鈉溶液于50 mL燒杯中，用封口膜將50 mL燒杯封口，在 65 ℃條件下50 mL燒杯中產(chǎn)生的15N 標(biāo)記氨氣被10 mL燒杯中的硫酸溶液吸收，10 min后打開封口膜；第三步，從上述10 mL燒杯中取2 mL的樣本于雙球反應(yīng)管[見圖3(a)]“A”球泡中，向雙球反應(yīng)管“B”球泡中加入1 mL堿性次溴酸鈉溶液[20]，將進(jìn)樣旋塞閥[見圖3(b)]的“1”連接抽真空系統(tǒng)，進(jìn)樣旋塞閥的“3”連接雙球反應(yīng)管的“4”，打開進(jìn)樣旋塞閥的閥門“2”，待真空度低于50 Pa后，關(guān)閉進(jìn)樣旋塞閥的閥門“2”，一同取下進(jìn)樣旋塞閥和雙球反應(yīng)管，將雙球反應(yīng)管“B”球泡中的次溴酸鈉溶液加入到“A”球泡中，反應(yīng)生成15N標(biāo)記氮?dú)狻⑦M(jìn)樣旋塞閥的“1”連接氣體同位素質(zhì)譜儀，將雙球反應(yīng)管放入液氮中，抽真空，待真空度達(dá)到儀器測試要求后，打開進(jìn)樣旋塞閥的閥門“2”，將生成的15N標(biāo)記氮?dú)庖霘怏w同位素質(zhì)譜儀中，檢測質(zhì)荷比為28、29和30的離子流強(qiáng)度，根據(jù)不同豐度范圍計(jì)算15N同位素豐度。

圖2 銨鹽吸收裝置示意

1.連接抽真空系統(tǒng)；2.進(jìn)樣旋塞閥的閥門；3、4.連接密封

1.4 15N同位素豐度計(jì)算

氮元素在自然界中有14N和15N等2種穩(wěn)定同位素，同位素分布有14N14N、14N15N、15N15N等3種組合形式，14N14N質(zhì)荷比為28，14N15N質(zhì)荷比為29，15N15N質(zhì)荷比為30。將反應(yīng)生成的15N標(biāo)記氮?dú)庖霘怏w同位素質(zhì)譜儀中檢測質(zhì)荷比為28、29和30的離子流強(qiáng)度，根據(jù)不同豐度范圍選擇不同的計(jì)算公式[21-22]。理論上式(1)和式(2)的計(jì)算結(jié)果是一致的，但當(dāng)15N同位素豐度≤10%時(shí)，由于質(zhì)荷比為30的離子流強(qiáng)度非常低，選擇式(1)計(jì)算15N同位素豐度；當(dāng)15N同位素豐度>10%時(shí)，為避免進(jìn)樣過程中微量空氣的漏入對(duì)質(zhì)荷比為28的離子流強(qiáng)度的干擾，選擇式(2)計(jì)算15N同位素豐度。

(1)

(2)

式中：E——待測物質(zhì)15N同位素豐度，%

I28、I29、I30——質(zhì)荷比分別為28、29、30的離子流強(qiáng)度，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 脲酶催化反應(yīng)時(shí)間

酶催化反應(yīng)具有溫和性、高效性和專一性三大特點(diǎn)，酶的溫和性是指酶催化反應(yīng)需要在相對(duì)適宜的pH和溫度條件下進(jìn)行，pH過高或過低都會(huì)導(dǎo)致酶失活，高溫也會(huì)導(dǎo)致酶失活，低溫則會(huì)導(dǎo)致酶的活性不足。脲酶活性最佳pH為7.4，15N標(biāo)記尿素與脲酶溶液的pH接近7.0，pH在適宜的范圍內(nèi)。脲酶在40～45 ℃反應(yīng)活性較高，因此選擇40 ℃作為酶催化反應(yīng)溫度。盡管酶的催化效率比無機(jī)催化劑更高，但反應(yīng)速率不如酸堿滴定反應(yīng)快，因此選擇合適的反應(yīng)時(shí)間是準(zhǔn)確測定15N同位素豐度的關(guān)鍵。40 ℃條件下過量的脲酶在1 h內(nèi)可將15N標(biāo)記尿素完全分解[17]。

在樣品前處理時(shí)將氫氧化鈉溶液加入50 mL燒杯后，燒杯中的溶液呈堿性，脲酶失活，脲酶催化反應(yīng)終止。因此，反應(yīng)時(shí)間是從向50 mL燒杯中加入蒸餾水開始，到加入氫氧化鈉溶液結(jié)束。

取10 mg15N同位素豐度為10.15%的15N標(biāo)記尿素為試驗(yàn)樣品，再取50 mg脲酶，銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間為10 min，檢測質(zhì)荷比為28的離子流強(qiáng)度，設(shè)置脲酶催化反應(yīng)時(shí)間為60 min的離子流強(qiáng)度為100%，其余脲酶催化反應(yīng)時(shí)間的相對(duì)強(qiáng)度見表1。脲酶催化反應(yīng)時(shí)間為2 min時(shí)生成的15N標(biāo)記氮?dú)廨^少，15N同位素豐度受本底影響偏低；反應(yīng)40 min后，質(zhì)荷比為28的離子流強(qiáng)度變化不明顯；反應(yīng)60 min時(shí)，15N標(biāo)記尿素已經(jīng)完全分解。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明脲酶催化反應(yīng)8 min后測定的15N同位素豐度與完全反應(yīng)(60 min)時(shí)的測試結(jié)果一致，為了縮短前處理時(shí)間，脲酶催化反應(yīng)時(shí)間選擇為10 min。

表1 不同脲酶催化反應(yīng)時(shí)間下的15N同位素豐度

2.2 銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間

第一步的脲酶催化反應(yīng)對(duì)15N標(biāo)記尿素轉(zhuǎn)化為15N標(biāo)記碳酸銨至關(guān)重要，第二步銨鹽吸收反應(yīng)是將15N標(biāo)記碳酸銨分解的15N標(biāo)記氨氣或氨水吸收到硫酸中，用作第三步制備15N標(biāo)記氮?dú)獾脑希诙戒@鹽吸收反應(yīng)起到了承上啟下的作用，銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間對(duì)15N同位素豐度的檢測至關(guān)重要。

試驗(yàn)時(shí)保持其他條件不變，僅改變第二步銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間，考察其對(duì)15N同位素豐度的影響。銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間是從銨鹽吸收裝置放入65 ℃水浴中開始，檢測質(zhì)荷比為28的離子流強(qiáng)度，設(shè)置銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間為80 min的離子流強(qiáng)度為100%，其余銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間的相對(duì)強(qiáng)度見表2。在65 ℃水浴條件下，15N標(biāo)記氨氣或氨水蒸氣釋放緩慢，銨鹽吸收反應(yīng)進(jìn)行60 min后，質(zhì)荷比為28的離子流強(qiáng)度變化不明顯；銨鹽吸收反應(yīng)進(jìn)行80 min時(shí)，15N標(biāo)記氨氣或氨水釋放完全。銨鹽吸收反應(yīng)發(fā)生2 min時(shí)生成的15N標(biāo)記氮?dú)廨^少，僅為儀器進(jìn)樣需求的三分之一，與銨鹽吸收反應(yīng)80 min時(shí)的15N同位素豐度差異不明顯。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明銨鹽吸收反應(yīng)進(jìn)行8 min后生成的15N標(biāo)記氮?dú)饪梢詽M足儀器進(jìn)樣要求，為了縮短前處理時(shí)間，銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間選擇為10 min。

表2 不同銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間下的15N同位素豐度

2.3 銨鹽吸收反應(yīng)溫度

除了反應(yīng)時(shí)間對(duì)銨鹽吸收過程有影響外，反應(yīng)溫度同樣起到了至關(guān)重要的作用，因此考察了銨鹽吸收反應(yīng)溫度對(duì)15N同位素豐度的影響。試驗(yàn)時(shí)保持其他條件不變，檢測質(zhì)荷比為28的離子流強(qiáng)度，設(shè)置銨鹽吸收反應(yīng)溫度為75 ℃的離子流強(qiáng)度為100%，其余銨鹽吸收反應(yīng)溫度的相對(duì)強(qiáng)度見表3。在25 ℃時(shí)，幾乎無氨氣溢出，次溴酸鈉反應(yīng)后無氣體生成；在35 ℃時(shí)，次溴酸鈉反應(yīng)后有少量氣體生成，15N同位素豐度受本底影響偏低；在銨鹽吸收反應(yīng)溫度達(dá)到45 ℃以上時(shí)，15N同位素豐度趨于穩(wěn)定，相對(duì)強(qiáng)度隨著銨鹽吸收反應(yīng)溫度的升高而增大，相對(duì)強(qiáng)度越大，15N同位素豐度的精密度越好；但在75 ℃時(shí)，銨鹽吸收裝置內(nèi)會(huì)產(chǎn)生霧氣，同時(shí)水浴鍋蒸發(fā)較快，因此銨鹽吸收反應(yīng)溫度選擇為65 ℃。

表3 不同銨鹽吸收反應(yīng)溫度下的15N同位素豐度

2.4 方法精密度

按脲酶催化法的前處理方式，對(duì)低豐度(10.15%)、中豐度(60.18%)和高豐度(98.14%)3組15N標(biāo)記尿素進(jìn)行15N同位素豐度測定，分別平行測定6次，結(jié)果見表4。3組不同豐度的15N標(biāo)記尿素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于0.3%，且隨著15N同位素豐度的增大，RSD逐漸減小，表明本方法在整個(gè)同位素豐度范圍內(nèi)精密度良好。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 不同檢測方法測定結(jié)果對(duì)比

采用微量高溫燃燒法和脲酶催化法兩種樣品前處理方式，對(duì)6組不同豐度的15N標(biāo)記尿素進(jìn)行同位素豐度測定(各平行測定3次)，結(jié)果見表5。兩種檢測方法在15N同位素豐度為0.365%～99.18%內(nèi)的偏差均小于0.2%，表明建立的檢測方法準(zhǔn)確度較高。

表5 微量高溫燃燒法與酶催化法測定結(jié)果對(duì)比

微量高溫燃燒法不具有專一性，對(duì)含氮有機(jī)試劑同樣適用；酶催化法利用脲酶的專一性，只分解15N標(biāo)記尿素，整個(gè)反應(yīng)無雜質(zhì)氣體生成。此外，酶催化法耗時(shí)0.5 h，微量高溫燃燒法至少耗時(shí)6 h。因此，酶催化法相對(duì)微量高溫燃燒法具有很大的優(yōu)勢。

3 結(jié)語

通過對(duì)脲酶催化反應(yīng)時(shí)間、銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間和溫度等參數(shù)進(jìn)行考察，確定最優(yōu)條件下脲酶催化反應(yīng)時(shí)間為10 min，銨鹽吸收反應(yīng)時(shí)間和溫度分別為10 min和65 ℃，開發(fā)了基于酶催化反應(yīng)測定15N標(biāo)記尿素同位素豐度的方法。采用微量高溫燃燒法和脲酶催化法測定不同15N同位素豐度的尿素樣品，兩種方法在15N同位素豐度為0.365%～99.18%內(nèi)的偏差均小于0.2%，表明建立的檢測方法準(zhǔn)確度較高。低、中、高3組不同15N標(biāo)記尿素的RSD均小于0.3%，表明方法在整個(gè)同位素豐度范圍內(nèi)精密度良好。建立的檢測方法適用于15N標(biāo)記尿素試劑同位素豐度的測定。