吳承帥 陳兵海

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)中次于膀胱癌的常見惡性腫瘤。腎細(xì)胞癌中以腎透明細(xì)胞癌最常見，故通常以腎癌簡稱。腎癌對(duì)傳統(tǒng)放化療的敏感性低，手術(shù)切除仍是局部腎癌的主要治療方法。然而，高達(dá)40%的局部腎癌在手術(shù)切除后最終仍可發(fā)展為轉(zhuǎn)移性腫瘤[1]。盡管多種靶向藥物已廣泛應(yīng)用于腎癌患者的治療，但患者的中位生存時(shí)間依舊低于預(yù)期[2]。因此，迫切需要尋找腎癌早期診斷的標(biāo)志物和治療的靶標(biāo)。

叉頭框蛋白 O4（forkhead box protein O4,FOXO4）是FOXO家族的一員，可參與細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程。在前列腺癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于正常組織，且FOXO4表達(dá)水平與這些腫瘤的進(jìn)展或預(yù)后密切相關(guān)[3-9]。Wang等[10]用腎癌組織與正常組織檢測(cè)FOXO4 mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示FOXO4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較正常組織明顯降低，并通過調(diào)節(jié)Bim而誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡。然而，F(xiàn)OXO4在腎癌中的其他作用及預(yù)后價(jià)值尚不清楚。因此，本研究利用在線數(shù)據(jù)庫中更大樣本分析FOXO4表達(dá)水平，并探討FOXO4對(duì)腎癌細(xì)胞生存能力的影響，分析其表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系及表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究FOXO4在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫可視化分析腎癌中FOXO4的表達(dá) Oncomine數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org/）是一個(gè)可用于檢索基因表達(dá)的公共數(shù)據(jù)資源庫[11]。首先，在搜索框中輸入FOXO4，對(duì)FOXO4基因在不同癌癥類型（cancer vs.normal）中的mRNA表達(dá)進(jìn)行可視化分析。閾值條件設(shè)置如下：P值為0.05，fold change為all，gene rank為top 10%，date type為 all。隨后，對(duì)FOXO4在腎癌的4個(gè)芯片數(shù)據(jù)集（包括Gumz Renal Statistics、Lenburg Renal Statistic、Jones Renal Statistics、Beroukhim Renal Statistics）中的mRNA表達(dá)進(jìn)行可視化分析。腎癌樣本和相應(yīng)正常腎組織樣本的數(shù)量、差異倍數(shù)和P值都在可視化結(jié)果中顯示。

1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析腎癌中FOXO4 mRNA和蛋白表達(dá)水平 UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/）是一個(gè)用于分析腫瘤數(shù)據(jù)的交互式網(wǎng)絡(luò)資源庫[12]?；谀[瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和臨床蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤分析聯(lián)盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium,CPTAC）數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，運(yùn)用UALCAN平臺(tái)對(duì)腎癌樣本和正常腎組織樣本中FOXO4 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行分析和可視化。具體如下，選擇UALCAN中的“TCGA analysis”工具，在搜索框中輸入FOXO4，根據(jù)個(gè)體癌癥分期和腫瘤分級(jí)，評(píng)估FOXO4在所有腎癌樣本和不同亞組中腎癌樣本中的mRNA表達(dá)水平。類似地，使用UALCAN的“CPTAC analysis”工具，在搜索框中輸入FOXO4，根據(jù)樣本類型評(píng)估FOXO4在腎癌樣本中的蛋白表達(dá)水平。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 769-P、786-O腎癌細(xì)胞系及HEK293T細(xì)胞均源自美國模式培養(yǎng)物集存庫。HK-2腎小管上皮細(xì)胞及其HK-2專用基礎(chǔ)培養(yǎng)基均購自上海中喬新舟生物科技有限公司。腎癌細(xì)胞系用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，而HEK293T細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基由10%FBS、1%青霉素-鏈霉素混合液及無血清培養(yǎng)基配制而成。FBS和無血清培養(yǎng)基均購自南京福麥斯生物科技有限公司，青霉素-鏈霉素混合液購自上海生工生物工程有限公司。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于37℃，5%CO2的孵育箱中。

1.4 FOXO4 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-qPCR法。根據(jù)組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒（上海超研生物科技有限公司）說明書提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度儀檢測(cè)總RNA的濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和基因擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：50℃ 15 min，85℃ 2 min；PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃10 s，60℃30 s，循環(huán)次數(shù)設(shè)為40。熔解曲線用于評(píng)估引物的特異性，其程序條件為：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceralde-3-phosphata dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參基因 。FOXO4引 物序 列 ：上 游 5'-CAGCCCTTCAGCCTATTCAG-3'， 下 游 5'-CTTGCCCAGCAAGAACTAGG-3'；GAPDH 引物序列：上游5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'， 下 游 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。 采 用 2-ΔΔCt法 計(jì) 算FOXO4相對(duì)表達(dá)水平。熒光定量PCR儀（型號(hào)：QuantStudio 5）購自美國Applied Biosystems公司。

1.5 FOXO4過表達(dá) 采用CRISPR/dCas9方法使FOXO4過表達(dá)[13]。具體如下，遵照SanPrep去除內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）說明書提取MPH、dCas9、REV、GAG、VSVG和MS2-sgRNA-FOXO4質(zhì)粒。REV、GAG和VSVG用于構(gòu)建慢病毒載體，它們的質(zhì)量比為：REV∶GAG∶VSVG=1 714 ng∶857 ng∶429 ng。隨后，應(yīng)用轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分別在HEK293T細(xì)胞中構(gòu)建Lenti-MPH、Lenti-dCas9和Lenti-FOXO4，且使它們相繼轉(zhuǎn)染到腎癌細(xì)胞系（769-P和786-O）。設(shè)置769-P和786-O細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)MPH、dCas9后為對(duì)照組，再以對(duì)照組為基礎(chǔ)過表達(dá)FOXO4后為實(shí)驗(yàn)組即FOXO4（+）。采用RT-qPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中FOXO4 mRNA表達(dá)水平，選擇穩(wěn)定過表達(dá)FOXO4的細(xì)胞作進(jìn)一步研究。

1.6 細(xì)胞存活能力檢測(cè) 采用溴化噻唑藍(lán)四氮唑（MTT）法。收集實(shí)驗(yàn)組FOXO4（+）和對(duì)照組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。將5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、72 h。隨后，將20 μl MTT（上海生工生物工程有限公司）試劑加入板中，將細(xì)胞與MTT試劑溶液（5 mg/ml）共同孵育4 h。接著將細(xì)胞與200 μl二甲基亞砜一起孵育10 min后，在酶標(biāo)儀上測(cè)量每個(gè)孔在570 nm處的吸光度值。酶標(biāo)儀（型號(hào)：MULTISKAN GO）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.7 FOXO4表達(dá)與腎癌預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier plotter在線數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/）用于評(píng)估大量基因表達(dá)對(duì)21種腫瘤預(yù)后的影響，包含530個(gè)腎透明細(xì)胞癌樣本[14]。本研究利用該數(shù)據(jù)庫來評(píng)估FOXO4表達(dá)在腎癌中的預(yù)后價(jià)值。根據(jù)FOXO4 mRNA表達(dá)的中位值和自動(dòng)選擇最佳截?cái)嘀祵⒛I癌樣本分為高表達(dá)組（227個(gè)樣本）和低表達(dá)組（303個(gè)樣本），通過Kaplan-Meier方法和log-rank檢驗(yàn)分析FOXO4表達(dá)與總生存期（overall survival,OS）之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8 預(yù)測(cè)和分析調(diào)節(jié)FOXO4在腎癌中表達(dá)的miRNA研究表明FOXO4在許多腫瘤類型中的表達(dá)受miRNA調(diào)控[15]。因此，本研究探討FOXO4在腎癌中的表達(dá)是否也受miRNA調(diào)節(jié)。為此，本研究使用StarBase、miRDB、TargetScan和miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)FOXO4的潛在調(diào)控miRNA。這4個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的共同miRNA被認(rèn)為是FOXO4表達(dá)調(diào)控的潛在miRNA。此外，StarBase數(shù)據(jù)庫中的517個(gè)腎癌樣本和71個(gè)正常對(duì)照樣本也用于分析潛在miRNA的表達(dá)，以及使用517個(gè)腎癌樣本分析FOXO4與其miRNA調(diào)節(jié)因子在腎癌中的表達(dá)相關(guān)性，根據(jù)miRNA表達(dá)的中位值將517個(gè)腎癌樣本分為高表達(dá)組（258個(gè)樣本）和低表達(dá)組（259個(gè)樣本），分析預(yù)后關(guān)系。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 1.8結(jié)果顯示hsamiR-142-3p是調(diào)控FOXO4表達(dá)的miRNA。本研究進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證FOXO4與hsa-miR-142-3p的靶向調(diào)節(jié)作用關(guān)系。首先，應(yīng)用StarBase數(shù)據(jù)庫獲得FOXO4與miR-142-3p的結(jié)合序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成野生型FOXO4-3'UTR和突變型FOXO4-3'UTR序列，將這兩個(gè)片段克隆到pmir-GLO熒光素酶報(bào)告基因載體上，分別構(gòu)建FOXO4野生型載體（FOXO4-WT）和FOXO4突變型載體（FOXO4-MUT）。接著，擴(kuò)增重組載體，并用SanPrep去除內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。隨后，將HEK293T細(xì)胞接種于24孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將FOXO4-WT和FOXO4-MUT質(zhì)粒和miR-142-3p模擬物或miR-142-3p陰性對(duì)照通過Lipofectamine 2000（美國Thermo Fisher Scientific公司）分別共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。48 h后，通過雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）檢測(cè)熒光素酶的活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。在Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫中使用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行預(yù)后分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎癌中FOXO4 mRNA和蛋白表達(dá) 通過Oncomine數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤，包括腎癌中FOXO4 mRNA表達(dá)下調(diào)（圖1a，見插頁）。進(jìn)一步分析FOXO4在不同腎癌數(shù)據(jù)集中的mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與正常腎組織樣本相比，腎癌樣本中FOXO4 mRNA表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.01）（圖1b，見插頁）。隨后，利用UALCAN平臺(tái)中來自TCGA數(shù)據(jù)庫的更多腎癌樣本分析了FOXO4 mRNA表達(dá)水平，與上述結(jié)果一致，腎癌樣本中FOXO4 mRNA表達(dá)水平亦明顯低于正常腎組織樣本（P＜0.01）（圖2a）。此外，與正常腎組織樣本相比，不同癌癥分期和腫瘤分級(jí)亞組中FOXO4 mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.01）；與Ⅰ期亞組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期亞組中FOXO4 mRNA表達(dá)水平均降低，而其表達(dá)在任何兩個(gè)腫瘤分級(jí)亞組中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）（圖2b和c）。利用UALCAN平臺(tái)比較了CPTAC數(shù)據(jù)庫的腎癌樣本與正常腎組織樣本中FOXO4蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常腎組織樣本相比，腎癌樣本中FOXO4蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.01）（圖2d）。

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫FOXO4在腎癌中的表達(dá)（a：腎癌樣本與正常腎組織樣本中FOXO4 mRNA表達(dá)箱線圖；b：基于腫瘤分期的腎癌亞組中FOXO4 mRNA表達(dá)箱線圖；c：基于腫瘤分級(jí)的腎癌亞組中FOXO4 mRNA表達(dá)箱線圖；d：腎癌樣本與正常腎組織樣本中FOXO4蛋白表達(dá)箱線圖）

2.2 FOXO4表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞生存的影響 為研究FOXO4對(duì)腎癌細(xì)胞存活能力的影響，首先檢測(cè)了FOXO4在兩個(gè)腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)。與腎癌組織結(jié)果一致，F(xiàn)OXO4在769-P和786-O細(xì)胞中的表達(dá)水平均低于人正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2（圖3a）。通過CRISPR/dCas9將FOXO4表達(dá)水平上調(diào)后（圖3b），769-P和786-O細(xì)胞存活水平明顯降低（圖3c和d），表明FOXO4對(duì)腎癌細(xì)胞的生長起到抑制作用。

圖3 FOXO4表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞生存的影響（a：FOXO4在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；b：通過CRISPR/dCas9方法在腎癌細(xì)胞中成功過表達(dá)FOXO4；c：FOXO4過表達(dá)的769-P細(xì)胞存活明顯降低；d：FOXO4過表達(dá)的786-O細(xì)胞存活明顯降低）

2.3 FOXO4表達(dá)與腎癌不良預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier plotter在線數(shù)據(jù)庫用于分析FOXO4表達(dá)與腎癌預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO4低表達(dá)組總生存率低于高表達(dá)組（P＜0.05）（圖4），表明FOXO4在腎癌中具有預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，可以作為一個(gè)新的預(yù)后生物標(biāo)志物。

圖4 FOXO4在腎癌中的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 FOXO4在腎癌中表達(dá)的miRNA調(diào)控因子的分析 通過整合4個(gè)在線數(shù)據(jù)庫來預(yù)測(cè)FOXO4表達(dá)的miRNA調(diào)控因子，共獲得715個(gè)miRNA。其中，hsamiR-142-3p是這4個(gè)數(shù)據(jù)庫的共同miRNA（圖5a）。分析StarBase數(shù)據(jù)庫的腎癌樣本及正常對(duì)照樣本數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照樣本相比，腎癌樣本中hsa-miR-142-3p表達(dá)明顯上調(diào)（圖 5b），hsa-miR-142-3p與FOXO4表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（圖5c），表明它們之間可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。此外，本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-142-3p高表達(dá)不利于腎癌的預(yù)后（圖5d），這與FOXO4低表達(dá)的預(yù)后意義一致。

圖5 腎癌中調(diào)節(jié)FOXO4表達(dá)的miRNA基因的預(yù)測(cè)和分析（a：FOXO4表達(dá)的預(yù)測(cè)miRNA調(diào)節(jié)因子的韋恩圖；b：腎癌中hsamiR-142-3p表達(dá)的箱線圖，**P＜0.01；c：腎癌中hsa-miR-142-3p與FOXO4的共表達(dá)分析；d：腎癌中hsa-miR-142-3p的Kaplan-Meier生存曲線）

2.5 Has-miR-142-3p與FOXO4在腎癌中具有靶向調(diào)控關(guān)系 基于目標(biāo)基因序列，本研究構(gòu)建了兩種不同的FOXO4-3'UTR突變體（圖6a）。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，在野生型FOXO4-3'UTR細(xì)胞中，熒光素酶活性相對(duì)降低，而FOXO4-3'UTR的兩個(gè)突變型都抑制了熒光素酶活性的降低（圖6b），表明FOXO4是hasmiR-142-3p在腎癌中調(diào)控的靶基因。

圖6 FOXO4受has-miR-142-3p靶向調(diào)節(jié)（a：構(gòu)建FOXO4-3'UTR突變型序列；b：FOXO4-3'UTR的兩種突變體都阻滯了熒光素酶活性的降低，*P＜0.05，nsP＞0.05）

3 討論

FOXO家族是FOX蛋白家族的一個(gè)亞家族，由FOXO1、FOXO3A、FOXO4和FOXO6 4個(gè)成員組成，這些成員參與著多種生理、病理過程，如細(xì)胞分化、存活和細(xì)胞代謝等[16-18]。在人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展中，它們可以抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因而被認(rèn)為是腫瘤抑制因子[19]。以往研究表明，F(xiàn)OXO4表達(dá)在多種人類腫瘤類型中明顯下調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)[20]。本研究結(jié)果表明FOXO4表達(dá)亦在腎癌中顯著降低，mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平，這與已報(bào)道的的研究結(jié)果一致[10]。在體外實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞中FOXO4也低表達(dá)，而FOXO4高表達(dá)可降低腎癌細(xì)胞的存活能力，表明FOXO4在腎癌中發(fā)揮抑癌作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)FOXO4低表達(dá)與腫瘤分級(jí)和分期有關(guān)，F(xiàn)OXO4低表達(dá)與腎癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，表明FOXO4在腎癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，也有望成為腎癌新的預(yù)后生物標(biāo)志物。

機(jī)制上，先前的研究已表明FOXO4是miRNA促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要靶標(biāo)[15，19]。例如，Wang等[21]揭示了miR-1274a可通過靶向FOXO4并抑制其表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和遷移。Liu等[22]研究結(jié)果顯示miR-499-5p可通過調(diào)節(jié)FOXO4表達(dá)而加速直腸癌細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。相似的研究結(jié)果也在宮頸癌、肺癌、鼻咽癌、骨肉瘤、結(jié)腸癌等腫瘤中有報(bào)道[23-27]。然而，在各種腫瘤類型中調(diào)節(jié)FOXO4表達(dá)的miRNA是不同的，這表明FOXO4表達(dá)的miRNA調(diào)節(jié)因子具有腫瘤類型依賴性。值得注意的是，F(xiàn)OXO4在腎癌中表達(dá)的miRNA調(diào)節(jié)因子尚未有研究報(bào)道。因此，本研究試圖探尋FOXO4在腎癌中表達(dá)的miRNA調(diào)節(jié)因子。結(jié)果顯示，hsa-miR-142-3p是不同預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫中FOXO4的共同miRNA。腎癌中hsa-miR-42-3p表達(dá)水平上調(diào)并與FOXO4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明hsa-miR-142-3p與FOXO4具有靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。隨后，本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了它們的靶向關(guān)系。

Hsa-miR-142-3p是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，在包括癌癥在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮重要作用[28]。先前的研究已表明hsa-miR-142-3p在腎癌組織中顯著上調(diào)并作為致癌基因發(fā)揮作用，下調(diào)hsa-miR-142-3表達(dá)可抑制腎癌細(xì)胞的生存、侵襲能力，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]。然而，hsa-miR-142-3p在腎癌中的分子機(jī)制尚未被揭示。因此，本研究結(jié)果或可為hsa-miR-142-3p參與腎癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制提供一定的證據(jù)和補(bǔ)充。

綜上所述，F(xiàn)OXO4參與了腎癌的發(fā)生、發(fā)展，有望作為腎癌的潛在分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。此外，本研究結(jié)果也可能為探尋hsa-miR-142-3p在腎癌中發(fā)揮作用的機(jī)制提供重要線索。