石哲瑋 錢(qián)彩珍 劉勝新 秦鋮璠 宣婧婧

病毒性心肌炎是一種由病毒感染引起的心臟炎癥性疾病[1]。自然界內(nèi)幾乎所有的病毒感染都可引起病毒性心肌炎，其中以呼吸道和腸道病毒最為多見(jiàn)?？滤_奇B3病毒（Coxsackievirus B3,CVB3）引起心肌炎約占所有病毒的40%～45%。由于目前臨床上缺乏有效的治療手段，所以暴發(fā)性心肌炎患者的死亡率仍較高[2]。尋找能夠有效緩解病毒感染引起心臟損傷的藥物有望降低病毒性心肌炎患者的死亡率。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞自主、有序的死亡模式，其已被證明參與了病毒性心肌炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[3]。同時(shí)，細(xì)胞凋亡程度與病毒性心肌炎小鼠的預(yù)后具有相關(guān)性。抑制CVB3感染引起的心肌細(xì)胞凋亡可減輕病毒性心肌炎小鼠的心肌損傷并改善心肌重構(gòu)[4]。

消退素是一類(lèi)具有促進(jìn)機(jī)體內(nèi)炎癥消退作用的多不飽和脂肪酸衍生物[5]。D類(lèi)消退素（Resolvin D,RvD）是消退素家族的重要組成部分。既往研究表明，RvD1可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]；同時(shí)，RvD1可抑制氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡從而減弱巨噬細(xì)胞的胞吞作用[7]。本研究通過(guò)檢測(cè)RvD2治療后病毒性心肌炎小鼠心肌組織凋亡程度和凋亡相關(guān)通路蛋白磷酸化水平以明確RvD2對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和動(dòng)物 CVB3 Nancy株由美國(guó)ATCC公司提供，所用Hep2細(xì)胞經(jīng)由中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心鑒定并提供。本研究通過(guò)向體外培養(yǎng)的Hep2細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CVB3病毒從而使CVB3活化增殖。待CVB3病毒造成75%的Hep2細(xì)胞損害時(shí)收集病毒，測(cè)定CVB3病毒滴度并稀釋至107TCID50/0.1 ml[8]。雄性BALB/c小鼠均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（滬）2012-0002］，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK（浙）2015-0009］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 RvD2購(gòu)自美國(guó)Cayman chemical公司（批號(hào)：10007279，規(guī)格：50 μg）；SC66購(gòu)自美國(guó)MCE公司（批號(hào)：HY-19832，規(guī)格：5 mg）；兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH；批號(hào)：#5174，規(guī)格：100 μl）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase,AKT；批號(hào)：#4685，規(guī)格：100 μl）、p-AKT（批號(hào)：#4060，規(guī)格：100 μl）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3；批號(hào)：#9662，規(guī)格：100 μl）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2；批號(hào)：#3498，規(guī)格：100 μl）和Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax；批號(hào)：#14796，規(guī)格：100 μl）單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)：BS13278，規(guī)格：100 μl）購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；病理染色試劑盒（批號(hào)：G1120，規(guī)格：100 ml）、蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：PC0020，規(guī)格：50T）購(gòu)自北京Solarbio公司；Multiskan SkyHigh酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；BX43生物顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒性心肌炎動(dòng)物模型構(gòu)建 雄性BALB/c小鼠40只，通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、病毒性心肌炎組、RvD2治療組、AKT抑制劑處理組，每組10只。正常對(duì)照組小鼠予腹腔注射0.2 ml、0.9%氯化鈉溶液作為對(duì)照。其余3組小鼠均腹腔接種含1.0×106滴度的CVB3病毒液0.2 ml，構(gòu)建病毒性心肌炎動(dòng)物模型；腹腔接種CVB3 6 h后，予RvD2治療組小鼠腹腔注射RvD2 0.25 ng·g-1·d-1，AKT抑制劑處理組小鼠腹腔注射 RvD2 0.25 ng·g-1·d-1和 AKT 抑制劑 5 μg·g-1·d-1。藥物處理7 d后處死4組小鼠，留取心臟組織和血清標(biāo)本。

1.3.2 小鼠心肌組織病理染色及評(píng)分 將正常對(duì)照組、病毒性心肌炎組、RvD2治療組小鼠心尖部心肌組織固定于4%多聚甲醛中。24 h后，沖洗殘留的多聚甲醛。脫水、石蠟包埋后制成含心肌組織的蠟塊，HE染色。由資深的病理科醫(yī)師對(duì)各組小鼠心肌組織中炎癥細(xì)胞分布情況進(jìn)行評(píng)分：0分為無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；1分為浸潤(rùn)面積0～＜25%，2分為浸潤(rùn)面積25%～＜50%,3分為浸潤(rùn)面積50%～＜75%；4分為浸潤(rùn)面積75%～100%。

1.3.3 小鼠血清肌鈣蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）和B型腦鈉肽（brain natriuretic peptide,BNP）水平檢測(cè)采用ELISA法。將所取血液樣本室溫放置1 h，靜待血液凝固后將其放入離心機(jī)中，在4℃溫度下2 000 r/min、離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒步驟檢測(cè)小鼠血清cTnI和BNP水平。

1.3.4 小鼠心肌組織p-AKT、AKT及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2水平檢測(cè) 采用Western blot法。將蛋白裂解液和小鼠心肌組織一同加入組織勻漿管中，將組織攪碎并在低溫環(huán)境下靜置30 min。以12 000 r/min離心30 min，取上清液，測(cè)定總蛋白水平。將所配得的蛋白體系通過(guò)10%分離膠跑開(kāi)后，在300 mA恒定電流的條件下轉(zhuǎn)膜90 min，用5%脫脂奶粉封閉 2 h，加入一抗 p-AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）和Bcl-2（1∶1 000）在4℃冰箱中孵育過(guò)夜。第2天取出孵育盒，TBS-Tween洗滌3次，10 min/次，在相應(yīng)的二抗中孵育2 h，再次用TBS-Tween洗3次，曝光、顯影。通過(guò)Image J軟件分析灰度值，p-AKT蛋白以AKT蛋白條帶作參照，Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)量與GAPDH蛋白量作比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠心臟組織炎癥反應(yīng)評(píng)分比較 與正常對(duì)照組炎癥反應(yīng)評(píng)分比較（0分），病毒性心肌炎組評(píng)分[（2.7±0.5）分]升高（P＜0.05）；與病毒性心肌炎組比較，RvD2治療組評(píng)分[（1.3±0.5）分]降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 3組小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察及炎癥反應(yīng)評(píng)分比較（HE染色，×200）

2.2 3組小鼠血清cTnI和BNP水平比較 與正常對(duì)照組比較，病毒性心肌炎組小鼠血清cTnI、BNP水平均增加（均P＜0.05）；而與病毒性心肌炎組比較，RvD2治療組小鼠血清cTnI、BNP水平均降低（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 3組小鼠血清cTnI和BNP表達(dá)水平比較（pg/ml）

2.3 3組小鼠心肌組織Caspase-3、Bax、Bcl-2水平比較 與正常對(duì)照組相比，病毒性心肌炎組小鼠心肌組織Caspase-3、Bax水平增加，而B(niǎo)cl-2水平降低（均P＜0.05）；與病毒性心肌炎組相比，RvD2治療組小鼠心肌組織Caspase-3、Bax水平降低，而B(niǎo)cl-2水平增加（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 3組小鼠心肌組織Caspase-3、Bax和Bcl-2水平比較

2.4 3組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平比較 與正常對(duì)照組相比，病毒性心肌炎組小鼠心肌組織內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平上調(diào)（P＜0.05）；與病毒性心肌炎組相比，RvD2治療組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 3組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平比較

2.5 4組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平和Caspase-3、Bax、Bcl-2水平比較 AKT抑制劑處理組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平較RvD2治療組下調(diào)（P＜0.05），Caspase-3、Bax水平較RvD2治療組增高，而B(niǎo)cl-2水平降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 4組小鼠心肌組織AKT蛋白磷酸化水平和Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白水平比較

3 討論

病毒性心肌炎在我國(guó)青少年和40歲以下成年人中多發(fā)，是青年患者心源性猝死的重要病因之一[9]。病毒性心肌炎的發(fā)病人數(shù)表現(xiàn)為逐年上升的趨勢(shì)，已威脅各國(guó)青少年的生命健康。因此，尋找能夠有效抑制病毒感染引起的心肌炎癥和心臟損傷的藥物對(duì)病毒性心肌炎患者的治療具有重要價(jià)值。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RvD2可有效減輕病毒性心肌炎小鼠的炎癥反應(yīng)，本研究進(jìn)一步闡明了RvD2在病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)對(duì)心肌組織凋亡的抑制作用。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一種細(xì)胞的程序性死亡。由于心肌細(xì)胞是人體內(nèi)的一種不可再生細(xì)胞，所以隨著心肌細(xì)胞死亡數(shù)量的增加，心臟功能受到顯著影響。既往研究表明，通過(guò)抑制心肌組織凋亡可發(fā)揮心臟保護(hù)作用。Sang等[10]的研究表明褪黑素可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡和自噬來(lái)減少CVB3感染引起的心肌損傷；Liu等[11]的研究表明給予病毒性心肌炎小鼠黃芪甲苷Ⅳ治療可減少心肌細(xì)胞凋亡，從而減少小鼠的死亡率。本研究通過(guò)ELISA法檢測(cè)了小鼠血清中cTnI、BNP水平，Western blot法檢測(cè)了小鼠心肌組織內(nèi)Caspase-3、Bcl-2和Bax水平。結(jié)果表明RvD2可降低病毒性心肌炎小鼠血清中cTnI、BNP水平，同時(shí)降低心肌組織中Caspase-3、Bax水平，增加Bcl-2水平。由此可見(jiàn)，RvD2可有效減少CVB3誘導(dǎo)的心肌損傷，同時(shí)抑制病毒性心肌炎小鼠心肌組織凋亡，從而發(fā)揮其心臟保護(hù)作用。

為了進(jìn)一步闡明RvD2在調(diào)控病毒性心肌炎小鼠心肌組織凋亡過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，本研究通過(guò)Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)通路蛋白磷酸化水平。既往研究表明，PI3K/AKT通路在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。Zhang等[13]的研究結(jié)果表明RvD2對(duì)AKT蛋白磷酸水平具有顯著的上調(diào)作用。本研究結(jié)果表明，在病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)RvD2可上調(diào)心肌組織內(nèi)AKT蛋白的磷酸化水平。在給予AKT抑制劑處理后，RvD2對(duì)AKT蛋白磷酸化水平的上調(diào)作用受到顯著抑制，Caspase-3、Bax水平上調(diào)，Bcl-2水平下調(diào)。由此可見(jiàn)，RvD2可通過(guò)調(diào)控AKT信號(hào)通路影響心肌組織凋亡水平。

綜上所述，本研究結(jié)果表明腹腔注射RvD2治療可有效抑制病毒性心肌炎小鼠血清中cTnI、BNP水平，減少心肌組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白水平，抑制心肌組織凋亡的發(fā)生，通過(guò)抑制AKT蛋白磷酸化水平可逆轉(zhuǎn)RvD2的抗凋亡作用。本研究證明RvD2可通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路降低心肌細(xì)胞凋亡程度，從而改善病毒性心肌炎小鼠的癥狀并降低其死亡率，預(yù)期可為病毒性心肌炎提供新的治療藥物。

但本研究也存在不足之處。首先，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法較為單一，后續(xù)可增加熒光染色技術(shù)，從而更加全面評(píng)估心肌細(xì)胞凋亡情況；其次，對(duì)于信號(hào)調(diào)控通路的研究尚不全面，后續(xù)可增加對(duì)AKT上下游蛋白的檢測(cè)，從而更好地闡明RvD2的抗凋亡機(jī)制。