李 賢，楊 蓮，吳鳳芝

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

0 引言

【研究意義】番茄（Solanum lycopersicum）作為一種重要的蔬菜作物，喜溫，對低溫極其敏感，當(dāng)環(huán)境溫度低于12 ℃時易遭受冷害[1]。在中國北方地區(qū)，低溫是越冬栽培的主要逆境，嚴(yán)重抑制番茄的生長發(fā)育[2]。因此，提高番茄的低溫耐受性對番茄的生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】前人研究發(fā)現(xiàn)褪黑素和多胺在調(diào)節(jié)植物抗逆過程中有著相似的作用，另外脅迫環(huán)境下褪黑素還可以調(diào)控植物體內(nèi)的多胺代謝。在干旱脅迫下褪黑素通過調(diào)節(jié)多胺代謝相關(guān)酶活性和基因表達水平，從而增強番茄耐熱性[3]。Gong等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在堿性環(huán)境中，經(jīng)褪黑素處理的蘋果植株中多胺合成酶ADC基因表達量提高，內(nèi)源Put、Spd和Spm的積累量增多，電解質(zhì)滲漏率降低，減輕了細(xì)胞膜損傷。張貴友等[5]發(fā)現(xiàn)褪黑素提高低溫環(huán)境下煙草細(xì)胞ADC的活性，促進Put的合成來提高煙草懸浮細(xì)胞存活率。而Ke等[6]研究表明，鹽脅迫下褪黑素通過抑制小麥葉片中多胺分解酶DAO和PAO活性，提高了Spd和Spm含量，降低了Put含量，有利于清除活性氧。這些結(jié)果表明，在不同植物中褪黑素通過調(diào)節(jié)多胺代謝，誘導(dǎo)不同種類多胺的積累，提高植物對脅迫的抗性[7]?！颈狙芯壳腥朦c】低溫脅迫下，褪黑素對番茄幼苗多胺代謝的影響如何？褪黑素主要通過影響哪種多胺來增強番茄耐冷性？該多胺主要通過哪條途徑合成的？尚不完全清楚。除此之外，前人研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥和西瓜等植物中褪黑素能誘導(dǎo)C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因、AtCOR15以及熱激蛋白基因（HSFs）等耐冷基因的表達，提高植物低溫脅迫耐受性[8-10]，在番茄響應(yīng)低溫脅迫時，ICE-CBF-COR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基 因 （SlICE1、SlCBF1、SlCBF3和SlCOR413）、MAPK激酶（SlMAPK3、SlZAT12）表達水平的上調(diào)，對提高番茄植株耐寒性具有重要意義。然而褪黑素是否可以通過提高番茄ICE-CBF-COR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因（SlICE1、SlCBF1、SlCBF3和SlCOR413）、MAPK激酶（SlMAPK3、SlZAT12）的表達來響應(yīng)低溫脅迫增強番茄幼苗耐寒性尚不完全清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以低溫敏感型番茄品種東農(nóng)708為試驗材料，采用褪黑素預(yù)處理的方法，分析低溫脅迫下番茄幼苗生長、多胺代謝相關(guān)指標(biāo)以及耐冷基因表達的變化；并施用腐胺合成抑制劑，分析其對褪黑素誘導(dǎo)的番茄葉片中多胺含量、膜脂過氧化損傷以及抗氧化酶活性的影響。通過研究明確褪黑素如何對低溫脅迫下番茄幼苗多胺代謝進行調(diào)控以及褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片耐冷基因表達的影響，以期進一步揭示褪黑素增強番茄幼苗耐冷性的機制，為褪黑素在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2019年5—12月進行。試驗材料為東農(nóng)708番茄品種（由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所提供），褪黑素（MT）、腐胺（Put）、Put合成抑制劑D-精氨酸（D-Arg）和二氟甲基鳥氨酸（DFMO），均購買自上海源葉生物技術(shù)公司。

1.1.1 褪黑素濃度篩選 將番茄種子于55 ℃下浸種消毒20 min后，置于恒溫培養(yǎng)箱中催芽，種子露白后在智能人工氣候植物培養(yǎng)箱（HPG-280HG）中播種于育苗盤內(nèi)，培養(yǎng)條件：溫度晝25 ℃/夜18 ℃（常溫），光照強度20 000 lx，光周期晝14 h/夜10 h，空氣濕度70%。幼苗長至2片真葉時分苗于塑料盆中（10 cm×10 cm）。待幼苗長至4葉1心時，分別用蒸餾水（CK）和濃度為 50 、100、200、300 μmol·L-1的外源MT于培養(yǎng)箱為黑夜條件時噴施于番茄葉片，以葉片滴水為度，每天噴1次，連續(xù)噴5 d后[11]，將番茄幼苗轉(zhuǎn)至另一培養(yǎng)箱進行低溫脅迫處理（晝15 ℃/夜10 ℃），培養(yǎng)箱除溫度設(shè)置改變外，其他參數(shù)保持不變。試驗設(shè)6個處理：①蒸餾水處理后常溫處理（CK）；②蒸餾水處理后低溫（C）；③50 μmol·L-1褪黑素處理后低溫處理（C+MT1）；④100 μmol·L-1褪黑素噴施后置于晝15 ℃/夜10 ℃（C+MT2）；⑤200 μmol·L-1褪黑素預(yù)噴施后置于晝 15 ℃/夜 10 ℃（C+MT3）；⑥300 μmol·L-1褪黑素噴施后置于晝 15 ℃/夜10 ℃（C+MT4）。在低溫處理的第0、2、4、8天采集番茄葉片，參考Li[12]的方法，根據(jù)番茄葉片MDA含量和電解質(zhì)滲漏率篩選出緩解番茄植株膜損傷效果最佳的褪黑素濃度用于后續(xù)試驗。

1.1.2 褪黑素對低溫脅迫下番茄多胺代謝的影響番茄幼苗的培育和褪黑素（濃度100 μmol·L-1）的處理方式及時間同褪黑素濃度篩選試驗，試驗設(shè)計4個處理：①常溫對照（CK）；②常溫下褪黑素處理（MT）；③低溫處理（C）；④褪黑素預(yù)處理后進行低溫處理（C+MT）。在低溫處理的第0、2、4、6、8天進行番茄葉片取樣，用于測定多胺代謝相關(guān)指標(biāo)（多胺和前體物質(zhì)含量、合成和分解酶活性及基因表達量）；在低溫處理的第8天，測定番茄幼苗的生長指標(biāo)。

為了探究低溫脅迫下褪黑素通過哪條途徑誘導(dǎo)Put的合成，以及Put是否在褪黑素提高番茄幼苗耐冷性中起重要作用，選用Put合成抑制劑：0.1 mmol·L-1的D-精氨酸（D-Arg，抑制精氨酸途徑）和二氟甲基鳥氨酸（DFMO，抑制鳥氨酸途徑）[13]。試驗共設(shè)5個處理：①常溫處理（CK）；②低溫處理（C）；③褪黑素預(yù)處理后低溫處理（C+MT）；④早上6:00用D-Arg預(yù)處理12 h后用褪黑素處理，聯(lián)合處理5 d后低溫處理（C+D-Arg+MT）；⑤早上 6:00用 DFMO處理，12 h后用褪黑素處理，聯(lián)合處理5 d后低溫處理（C+DFMO+MT）。未經(jīng)抑制劑處理的組（①-③）在同一時間噴施蒸餾水或褪黑素。在低溫處理的第4天進行番茄葉片取樣，測定多胺含量、MDA含量、電解質(zhì)滲透率和抗氧化酶活性。

1.1.3 褪黑素對低溫脅迫下番茄耐冷基因表達的影響試驗設(shè)計及褪黑素處理方式同1.1.2，褪黑素預(yù)處理后進行5 ℃低溫處理，在低溫處理的第0、1、3、6、12和24 h選取番茄幼嫩葉片取樣，分析SlMAPK3、SlICE1、SlCBF1、SlCBF3、SlCOR413和SlZAT12基因的表達情況。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 丙二醛含量和電解質(zhì)滲漏率的測定 采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量[14]；電解質(zhì)滲透率的測定參考Ishitani等[15]的方法。

1.2.2 生長指標(biāo)的測定 用直尺測量番茄植株莖基部到生長點的長度作為株高，然后用清水將植株洗干凈，擦干水分后將植株地上部和地下部分開，用電子天平稱量鮮質(zhì)量；然后在80 ℃下烘干至恒重后稱量干質(zhì)量。

1.2.3 抗氧化酶活性的測定 配制磷酸緩沖溶液，作為番茄中的抗氧化酶的提取液，緩沖溶液由50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.8）、50 mmol·L-1EDTA二鈉鹽和2%（m/V）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）組成。稱取0.3 g番茄葉片于研缽中，加入5 mL預(yù)冷的磷酸緩沖溶液，在冰浴中快速研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，在4 ℃下離心（15 000 g，25 min）。取上清液用于測定抗氧化酶活性，SOD酶活性參考Giannopotitis[16]的方法進行測定；POD活性根據(jù)Nickel[17]的方法進行測定；CAT活性按照Dhindsa等[18]的方法測定；APX活性的測定參考Pinhero[19]的方法，略有改動。

1.2.4 多胺含量的測定 多胺含量的測定方法參考Duan等[20]的方法，略作修改。番茄葉片中的多胺用5%高氯酸（HClO4）提取，經(jīng)苯甲酰氯衍生化后用乙醚萃取，多胺的分離采用高效液相色譜法，色譜柱采用 C18液相色譜柱（Hypersil BDS C18，4.0×150 mm，5 μm ），檢測器為 Waters 2998紫外檢測器，檢測波長為254 nm，流動相為V（甲醇）∶V（水）=3∶2，流速保持 1 mL· min-1。

1.2.5 多胺合成酶活性測定 參考Zhao等[21]的方法測定番茄葉片中多胺合成酶活性，略作修改。番茄葉片在預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（pH 8.0）中研磨，離心所得的上清液為酶提取液，取酶提取液，與L-精氨酸（25 mmol·L-1，測定 ADC 酶活性）、L-鳥氨酸（25 mmol·L-1，測定ODC酶活性）或S-腺苷甲硫氨酸（25 mmol·L-1，測定SAMDC活性）進行反應(yīng)，離心后上清液用苯甲酰氯衍生，衍生產(chǎn)物用乙醚萃取，收集乙醚相吹干并溶于甲醇中，然后檢測254 nm處的OD值。

1.2.6 多胺分解酶活性測定 參考Su[22]的方法測定番茄葉片中多胺分解酶活性。配制磷酸緩沖液（pH 6.5），用于提取番茄葉片中的酶，取酶提取液，加入辣根過氧化物酶溶液（250 U·mL-1）和顯色液（10 mg 4-氨基氨替吡啉和25 μL N，N-二甲基苯胺），于30 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng) 5 min，加入 Put（20 mmol·L-1，測定 DAO活性）或 Spd+Spm（20 mmol·L-1，測定PAO活性），測定555 nm處連續(xù)的OD值，以每分鐘OD值變化0.001為1個酶活力單位。

1.2.7 多胺合成前體物質(zhì)含量測定 采用異硫氰酸苯酯（PITC）衍生法[23]分析番茄葉片中多胺前體物質(zhì)精氨酸、鳥氨酸和甲硫氨酸的含量。取番茄葉片，在液氮中快速研磨成粉末，然后加入HCl進行提取，4 ℃下離心30 min后取上清液進行衍生，衍生液由三乙胺、乙腈和異硫氰酸苯酯溶液組成，混合液在室溫下靜置1 h，然后加入正己烷進行萃取，收集下層清液用于高效液相色譜-紫外檢測分析，波長為254 nm，色譜柱采用ACE Excel SuperC18 5 μm 4.6×250 mm色譜柱，進樣量20 μL，流動相A為50 mmol·L-1V（乙酸鈉）（用乙酸調(diào)節(jié)pH至6.5）∶V（乙腈）=93∶7，流動相 B為V（乙腈）∶V（水）=4∶1，梯度洗脫，洗脫程序如表1所示。

表1 多胺合成前體物質(zhì)檢測流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase elution for detection of polyamine synthesis precursors

1.2.8 基因表達量的測定 用Trizol試劑提取番茄葉片總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，基因特異引物（表2）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。在Analytic jena熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)，采用2-ΔΔt法計算基因的相對表達量。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences used in qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，方差分析采用Turkey’s HSD，在P＜0.05水平下進行分析，使用Origin 2017繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對低溫脅迫下番茄膜脂過氧化損傷和生長的影響

如圖1所示，與對照相比，低溫脅迫下番茄幼苗葉片中MDA含量和電解質(zhì)滲漏率顯著提高（P＜0.05），而MTx預(yù)處理不同程度地降低了MDA含量和電解質(zhì)滲漏率，當(dāng)褪黑素濃度為100 μmol·L-1時上述兩個指標(biāo)降低幅度最大，且顯著低于單獨低溫處理（P＜0.05），因此選用 100 μmol·L-1的 MT 進行后續(xù)試驗。如表3 所示，常溫下MT處理對番茄幼苗的生長無影響，低溫脅迫下番茄幼苗的株高、地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量以及全株鮮重和干重顯著低于對照（P＜0.05）；與低溫脅迫相比，低溫脅迫下MT預(yù)處理顯著提高了番茄植株的上述生長指標(biāo)（P＜0.05）。

表3 褪黑素對低溫脅迫下番茄幼苗生長的影響Table 3 Effects of melatonin spray on growth of tomato seedlings under low temperature stress

2.2 褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片多胺代謝的影響

2.2.1 褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片多胺及前體物質(zhì)含量的影響 如圖2所示，常溫下MT處理對3種多胺的含量無影響；與對照相比，低溫脅迫初期（第2天）番茄葉片中3種多胺以及前體物質(zhì)Arg與Met的含量顯著增加，第4～6天Spd、Spm和Met含量顯著降低（P＜0.05）；低溫脅迫下MT預(yù)處理的番茄葉片中Put與Arg含量在所有時期顯著高于低溫處理，Spd、Spm和Met含量僅在第2天差異顯著（P＜0.05），表明低溫脅迫下MT預(yù)處理主要提高了低溫脅迫下番茄葉片中Put和Arg的含量。

2.2.2 褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片多胺合成酶活性的影響 如圖3 所示，與對照相比，低溫脅迫下番茄葉片中的ADC活性在整個低溫處理期間顯著提高，ODC和SAMDC活性在第2天顯著提高，SAMDC在第4~6天顯著降低（P＜0.05）；低溫脅迫下MT預(yù)處理進一步提高了番茄葉片中ADC活性，且在各時期差異均顯著，而ODC活性無明顯變化，SAMDC活性僅在第2天差異達到顯著水平（P＜0.05）。從低溫脅迫下經(jīng)MT預(yù)處理的番茄葉片中多胺合成酶和前體物質(zhì)含量的變化情況可初步推測在Put的兩條合成途徑中，精氨酸途徑可能是MT誘導(dǎo)的番茄葉片中Put合成的主要途徑。

2.2.3 褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片多胺合成酶基因表達的影響 如圖4 所示，與對照相比，低溫脅迫顯著提高了所有時期番茄葉片中SlADC1與SlADC2的相對表達量，SlSAMDC1基因表達量在第2天顯著提高，第4~6天顯著降低，SlSAMDC2基因表達量在第4~8天顯著降低（P＜0.05）；MT預(yù)處理進一步提高了SlADC1與SlADC2的相對表達量，且在低溫處理的各時期差異均顯著，SlSAMDC1的相對表達量在第2天差異達到顯著水平，其余時期差異不顯著（P>0.05）。

2.2.4 褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片多胺分解酶活性及其基因表達的影響 如圖5 所示，對照和常溫下MT處理的番茄葉片中DAO和PAO活性較穩(wěn)定；低溫脅迫顯著提高了番茄葉片DAO和PAO活性及基因相對表達量（SlDAO和SlPAO），且隨著低溫處理時間的延長呈升高趨勢（除了第8天的PAO）（P＜0.05）；MT預(yù)處理顯著抑制了低溫脅迫下DAO活性和SlDAO相對表達量的升高，且在低溫處理的各時期差異均達到顯著水平，而對PAO活性及SlPAO相對表達量無顯著影響（P>0.05）。

2.3 腐胺合成抑制劑對褪黑素誘導(dǎo)的番茄葉片多胺含量和抗氧化特性的影響

為了進一步探究低溫脅迫下MT誘導(dǎo)的番茄葉片中Put的合成主要通過哪條途徑，以及探究Put是否介導(dǎo)了MT對番茄幼苗抗氧化特性的增強作用，選用兩種Put合成抑制D-Arg（抑制精氨酸途徑）和DFMO（抑制鳥氨酸途徑）進行研究。

2.3.1 腐胺合成抑制劑對褪黑素誘導(dǎo)的番茄葉片多胺含量的影響 如圖6 所示，低溫脅迫下MT預(yù)處理能顯著提高番茄葉片中Put的含量，采用精氨酸脫羧酶抑制劑D-Arg與褪黑素聯(lián)合預(yù)處理，番茄葉片中Put含量顯著低于MT預(yù)處理的植株，Spd和Spm含量也顯著降低（P＜0.05）；而采用鳥氨酸脫羧酶抑制劑DFMO與褪黑素聯(lián)合預(yù)處理，MT誘導(dǎo)的Put含量不變。說明低溫脅迫下MT誘導(dǎo)的番茄葉片中Put的合成主要通過精氨酸途徑。

2.3.2 腐胺合成抑制劑對褪黑素誘導(dǎo)的番茄葉片膜脂過氧化損傷和抗氧化酶活性的影響 如圖7 所示，低溫脅迫下MT預(yù)處理的番茄葉片中MDA含量和電解質(zhì)滲漏率顯著低于低溫處理，SOD、POD、CAT和APX活性顯著高于低溫處理，然而與低溫脅迫下MT預(yù)處理相比，D-Arg與MT聯(lián)合預(yù)處理MDA含量、電解質(zhì)滲漏率顯著提高，抗氧化酶活性顯著降低（P＜0.05），恢復(fù)至單獨低溫處理的水平，而DFMO與MT聯(lián)合預(yù)處理上述指標(biāo)沒有顯著變化。

上述2.2和2.3的結(jié)果表明低溫脅迫下MT通過正向調(diào)節(jié)Arg途徑促進番茄葉片中Put合成，以及下調(diào)Put分解酶DAO基因表達，抑制DAO活性，從而促使Put積累，清除細(xì)胞過量ROS，減輕番茄植株所受的膜脂過氧化損傷。

2.4 褪黑素對低溫脅迫下番茄葉片耐冷基因表達的影響

如圖8 所示，低溫脅迫誘導(dǎo)了番茄葉片中耐冷基因的表達，其中SlICE1和SlCBF3在低溫處理1 h時達到最大值，SlCBF1和SlMAPK3在3 h時達到最大值，SlCOR413和SlZAT12在6 h時達到最大值；低溫脅迫下褪黑素預(yù)處理在不同程度上進一步提高了番茄葉片中上述基因的表達量，與低溫處理相比SlICE1和SlMAPK3基因相對表達量在1～6 h顯著上調(diào)（P＜0.05）；SlCBF1在12 h內(nèi)差異均達到顯著水平，比僅低溫處理提高了36.10%~82.14%（P＜0.05）；SlCBF3除了12 h時，差異均顯著（P＜0.05）；SlCOR413在3~24 h差異顯著，6 h時增幅最大，達到49.23%；SlZAT12的表達量在低溫處理的所有時期均顯著提高，3 h時增幅最大，比低溫處理提高了172.63%（P＜0.05）。

3 討論

3.1 褪黑素影響低溫脅迫下番茄幼苗膜脂過氧化

細(xì)胞膜系統(tǒng)是植物遭受冷害的主要部位[24]，低溫脅迫下植物CO2同化過程受到抑制，植物對光能的吸收和利用失衡，引起ROS過量積累，導(dǎo)致膜脂過氧化，MDA積累，膜透性變大，導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，引起植物細(xì)胞膜氧化損傷，抑制植物生長[25]。因此，MDA和電解質(zhì)滲漏率通常被認(rèn)為是判斷膜結(jié)構(gòu)是否完整的指標(biāo)，用來衡量植物遭受脅迫傷害的程度[26]。本研究中，番茄在低溫脅迫期間，其葉片MDA含量和電解質(zhì)滲漏率持續(xù)增加，株高和鮮/干質(zhì)量顯著降低，表明低溫對番茄造成了氧化損傷，且這一傷害隨低溫脅迫時間的延續(xù)而加劇，這與刁倩楠等[27]的研究結(jié)果一致。同時本研究還發(fā)現(xiàn)相較于單獨低溫處理，100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理后再進行低溫處理能顯著降低番茄葉片中MDA含量和電解質(zhì)滲漏率，增加番茄幼苗株高和干鮮質(zhì)量，這表明褪黑素能減輕低溫脅迫對番茄植株造成的膜脂過氧化損傷，保護細(xì)胞膜系統(tǒng)，同時緩解低溫脅迫對番茄幼苗生長的抑制作用，這與鹽脅迫下褪黑素對黃瓜幼苗的影響研究結(jié)果一致[28]。但褪黑素具體是如何緩解低溫脅迫導(dǎo)致的膜脂過氧化需做進一步研究探討。

3.2 褪黑素影響低溫脅迫下番茄的多胺代謝

當(dāng)脅迫存在時，外源褪黑素可以提高植物體內(nèi)多胺的水平[29]。例如高溫脅迫下褪黑素可通過提高多胺合成酶基因的表達促進番茄葉片中多胺的合成，強化抗氧化系統(tǒng)來增強番茄幼苗耐熱性[30]。Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)在澇害環(huán)境下外源施用褪黑素，苜蓿葉片中多胺合成酶活性增加，分解酶活性降低，多胺含量大幅度增加。在低溫脅迫下，褪黑素通過提高Put和Spd水平，穩(wěn)定Spm水平，減輕了黃瓜幼苗低溫脅迫[32]，這與我們的研究結(jié)果有所差異，本研究中，低溫處理的各個時段，褪黑素預(yù)處理后低溫處理的番茄葉片中Put含量均顯著高于單獨低溫處理，但Spd和Spm的含量雖有所提高，但除第2天外均未達到顯著水平，這可能是由于Put、Spd和Spm這3種多胺在不同的物種中及不同的脅迫下的響應(yīng)存在差異。本研究結(jié)果表明，在低溫脅迫下褪黑素對番茄葉片中Put的積累有積極作用。有研究表明腐胺（Put）作為植物抵御冷害的一種保護性物質(zhì)，其含量越高，植物抗寒能力越強[33]，Song[34]的研究也發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下番茄中植株中Put含量增加，植株耐寒性增強，這是因為腐胺帶正電荷，能與細(xì)胞磷脂和核酸等結(jié)合，加強對細(xì)胞膜等組織的保護作用；其次腐胺作為一種可溶性物質(zhì)，在脅迫環(huán)境下能夠幫助平衡細(xì)胞的滲透壓，保持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，防止細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)外滲，以提高植物耐冷性；再者腐胺能調(diào)節(jié)活性氧代謝平衡減輕植物脅迫損傷[35,36]。上述研究均表明低溫脅迫下褪黑素很可能是通過番茄中腐胺含量，從而緩解低溫脅迫導(dǎo)致的膜脂過氧化。

對褪黑素具體如何影響低溫脅迫下腐胺在植株體內(nèi)的積累，我們做了進一步的研究探討，在植物體內(nèi)Put的合成途徑主要有精氨酸（Arg）途徑和鳥氨酸（Orn）途徑（對應(yīng)2個合成前體Arg和Orn），分別由精氨酸脫羧酶（ADC）和鳥氨酸脫羧酶（ODC）催化[13]。本試驗結(jié)果表明低溫處理前用褪黑素預(yù)處理的番茄葉片中Arg含量、ADC活性以及ADC合成相關(guān)基因的表達水平顯著高于低溫處理，而Orn含量、ODC活性與ODC合成相關(guān)基因的表達水平無顯著變化，這表明低溫脅迫下褪黑素是通過誘導(dǎo)ADC催化精氨酸途徑介導(dǎo)腐胺的合成緩解低溫脅迫。為了驗證這一結(jié)論，我們用精氨酸途徑抑制劑D-精氨酸（D-Arg）和鳥氨酸途徑抑制劑二氟甲基鳥氨酸（DFMO）分別與褪黑素進行了聯(lián)合預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下，D-Arg顯著降低了褪黑素誘導(dǎo)的番茄葉片中Put的含量，而DFMO對褪黑素誘導(dǎo)的Put的含量無影響，這進一步表明褪黑素誘導(dǎo)低溫脅迫下番茄葉片中Put的合成主要是通過精氨酸途徑，同時，相較于MT預(yù)處理，D-Arg與MT聯(lián)合預(yù)處理的番茄在低溫脅迫下，其葉片MDA含量、電解質(zhì)滲漏率顯著提高，抗氧化酶活性顯著降低，恢復(fù)至單獨低溫處理的水平，而DFMO與MT聯(lián)合預(yù)處理后上述指標(biāo)沒有顯著變化。這說明褪黑素可能是通過影響介導(dǎo)Put合成的精氨酸途徑來減輕低溫脅迫下番茄葉片細(xì)胞膜脂過氧化損傷程度以及增強抗氧化酶活性。

3.3 褪黑素影響低溫脅迫下番茄幼苗耐冷基因的表達

植物已進化出多種策略應(yīng)對包括冷脅迫在內(nèi)的多種環(huán)境脅迫。前人研究發(fā)現(xiàn)植物的細(xì)胞膜首先上感知脅迫信號，隨后轉(zhuǎn)導(dǎo)至第二信使，并激活下游脅迫響應(yīng)基因，最終誘導(dǎo)整個植物水平的保護性生理響應(yīng)[37]。目前在植物低溫響應(yīng)中，以CBF轉(zhuǎn)錄因子為核心的ICE1-CBF-COR信號感知-轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被研究得最為清楚。

研究發(fā)現(xiàn)植物在感知到低溫信號后，其轉(zhuǎn)錄因子CBFs基因會被迅速誘導(dǎo)表達，隨后CBFs蛋白通過與下游冷響應(yīng)基因COR的特定順式元件進行結(jié)合來激活冷響應(yīng)基因，從而增強植物的抗寒性[38,39]。番茄有3個CBFs基因，SlCBF1基因表達與植株耐寒性呈正相關(guān)[40]，因此，SlCBF1表達水平通常被用來量化番茄植株的抗寒性。此外，ICE1作為CBF的誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)CBF1表達，有研究就表明，低溫脅迫下番茄SlICE1的高表達提高了SlCBF1的表達量，增強了番茄的抗寒性[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄葉片中SlICE1、SlCBF1和SlCBF3在低溫處理中的相對表達量顯著高于空白對照，同時在褪黑素與低溫聯(lián)合處理中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于僅低溫處理，這與Shi等[8]在擬南芥上的研究結(jié)果一致。COR蛋白是植物冷害調(diào)節(jié)通路ICE1-CBF/DREB1-COR的終末蛋白[32]。有研究發(fā)現(xiàn)在番茄植株中SlCOR413的過表達減輕了低溫引起的葉綠體膜和結(jié)構(gòu)的損傷，而抑制SlCOR413的表達則加重了葉綠體損傷[41]。低溫脅迫會誘導(dǎo)SlCOR413表達，有助于增強番茄對低溫脅迫的抗性[42]，與本研究的結(jié)果一致。另外本研究中還發(fā)現(xiàn)褪黑素顯著增加了低溫脅迫下番茄葉片中SlCOR413的相對表達量，這表明褪黑素可以保護低溫脅迫下番茄的葉綠體膜，以維持葉綠體相對正常的功能和較高的光合能力來對抗冷害。綜上，褪黑素能夠通過提高低溫脅迫下番茄葉片ICE1-CBF-COR通路基因（SlICE1、SlCBF1、SlCBF3、SlCOR413）的轉(zhuǎn)錄水平，正向調(diào)節(jié)番茄對低溫脅迫的響應(yīng)。而Kou等[43]的研究發(fā)現(xiàn)腐胺處理植株及SaADC1轉(zhuǎn)基因株系中CBFs的表達明顯被增強，在轉(zhuǎn)基因株系中CBF下游的基因CORs的表達同樣得到增強，說明CBF-COR途徑可能會受ADC1介導(dǎo)的腐胺合成途徑影響，促進低溫相關(guān)代謝物質(zhì)的積累，從而調(diào)節(jié)馬鈴薯的低溫抗性，因此我們推測，褪黑素可能是通過提高番茄葉片中腐胺含量促進CBFs和CORs基因上調(diào)表達進而增強植株耐寒性。

在ICE1-CBF-COR信號通路中，ICE1作為上游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控CBFs基因，與植物低溫脅迫抗性密切相關(guān)[44]。有研究表明植物的CBFs基因會在低溫誘導(dǎo)的前期得到一定程度的積累，增強植物對低溫的耐受性，但CBFs基因的過高表達對植物反而是一種傷害[45,46]，這時植物便會通過MAPK3/6磷酸化ICE1蛋白，抑制CBFs基因的過表達，使植物能夠順利抵御低溫脅迫的同時還能良好生長[47,48]。Ramirez等[49]研究也表明MPK3/6-ICE1-CBF調(diào)控途徑創(chuàng)造了低溫脅迫和生長之間的平衡，從而提高植物暴露到低溫脅迫下的存活率。Wang等[50]研究表明低溫脅迫能激活SlMAPK3增強番茄的耐冷性，這與本研究結(jié)果一致。在本研究中我們還發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下褪黑素處理顯著提高了SlMAPK3基因表達量，有研究表明Spm能夠活化MAPK，誘導(dǎo)MAPK相關(guān)基因的表達[51]。而Spm的合成離不開腐胺，同時我們的研究已發(fā)現(xiàn)褪黑素可以促進低溫脅迫下番茄葉片中腐胺的合成，因此我們猜測褪黑素可能是通過誘導(dǎo)腐胺的合成影響SlMAPK3基因，促使ICE1蛋白磷酸化減輕因低溫脅迫誘導(dǎo)的CBFs基因的過表達而對生長發(fā)育造成的抑制作用，使得植株在抵御低溫脅迫得同時還能正常生長發(fā)育。

ZAT12是鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在激活活性氧信號通路以及抗氧化系統(tǒng)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[52]。Bajwa等[9]發(fā)現(xiàn)，C2H2型鋅指蛋白和CBFs均參與擬南芥中褪黑激素介導(dǎo)的低溫應(yīng)激反應(yīng)。本試驗研究結(jié)果表明低溫脅迫下褪黑素預(yù)處理顯著提高了低溫脅迫下SlZAT12基因的表達量，這與Li等[53]在平邑甜茶上的研究結(jié)果一致。并且褪黑素預(yù)處理提高了低溫脅迫下番茄葉片抗氧化酶的活性，因此褪黑素可能通過激活番茄植株中ROS信號通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因SlZAT12的表達，增強抗氧化系統(tǒng)，緩解番茄植株氧化損傷。除此之外，Zhao等[54]研究發(fā)現(xiàn)在低溫條件下ZAT12通過上調(diào)ADC1和ADC2表達觸發(fā)精氨酸途徑，進而促進Put合成，這表明褪黑素可能通過提高SlZAT12的表達水平促進腐胺的合成，從而增強番茄植株的抗寒性。

4 結(jié)論

100 μmol·L-1的褪黑素可通過正向調(diào)節(jié)精氨酸途徑促進Put合成，以及抑制Put分解來增加Put的積累量，這減輕了番茄的膜脂過氧化損傷，提高了番茄抗氧化能力，緩解低溫脅迫對番茄幼苗生長的抑制作用。除此之外，褪黑素促進了番茄葉片中與腐胺密切相關(guān)的低溫響應(yīng)基因表達，增強了番茄幼苗低溫脅迫耐受性。褪黑素可能通過影響腐胺的合成，調(diào)控耐冷基因表達，從而提高番茄植株低溫脅迫耐受性，更深入的機理有待進一步驗證。