林裕勝，劉維巍,，張 龍,，江錦秀，張靖鵬，劉慶華，胡奇林

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】羊口瘡病毒（Orf virus，ORFV）是羊口瘡（Orf）的病原體，屬于痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒屬，同屬成員還有牛丘疹性口炎病毒、偽牛痘病毒和新西蘭馬鹿副痘病毒[1]。ORF主要發(fā)生在山羊上，綿羊偶有發(fā)生，但在其他動(dòng)物物種和人身上也有發(fā)生的報(bào)道，是一種接觸性、嗜上皮性的人畜共患病[2-4]。了解ORFV流行毒株主要基因的遺傳特性，不僅可以為有效防控該病的發(fā)生提供理論依據(jù)，還可為后續(xù)基因缺失苗的構(gòu)建及致病機(jī)制的解析奠定研究基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ORFV是一個(gè)線性雙鏈的DNA分子，基因組長(zhǎng)度約138 kb，編碼134個(gè)基因[5-6]。中心區(qū)域高度保守，主要參與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和病毒結(jié)構(gòu)的形成[7-8]；而末端區(qū)域變異性較大，可能與ORFV典型的再感染現(xiàn)象有關(guān)，是病毒基因調(diào)控宿主先天免疫反應(yīng)的產(chǎn)物[9]。幾乎所有發(fā)生該病的國(guó)家研究機(jī)構(gòu)都有開(kāi)展ORFV的基因遺傳變異分析，這些研究主要基于囊膜基因（B2L）、F1L基因、病毒干擾素基因（VIR）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因進(jìn)行分析[2]。F1L基因編碼的F1L蛋白是ORFV 主要的免疫優(yōu)勢(shì)抗原，刺激宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)[10]。B2L基因編碼的B2L蛋白是一個(gè)保守且免疫原性較高的囊膜蛋白，是ORFV的保護(hù)性抗原之一[11]。GIF可以抑制巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白細(xì)胞介素2的活性，幫助ORFV在宿主體內(nèi)存活[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前Orf在我國(guó)山東、廣西、陜西、新疆、河南、黑龍江、云南、安徽、海南、吉林和福建等地均有發(fā)生的報(bào)道，給養(yǎng)羊戶造成了較大經(jīng)濟(jì)損失，并且出現(xiàn)了該病感染人病例[13-16]。福建省羊場(chǎng)ORFV的變異情況有待深入探討。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選取4份2021年福建省臨床樣品ORFV檢測(cè)陽(yáng)性但未免疫ORFV疫苗的病料，克隆其F1L、B2L和GIF基因并分析了這3個(gè)基因的遺傳變異情況，為福建省有效防控Orf提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源與毒株 收集2021年在福建省養(yǎng)羊場(chǎng)發(fā)生疑似Orf患羊痂皮，經(jīng)PCR檢測(cè)ORFV為陽(yáng)性但未免疫ORFV疫苗的病料，從中選出具有代表性的4份臨床樣品進(jìn)行研究。對(duì)選取的4份臨床樣品按照采集的時(shí)間及地點(diǎn)，分別命名為FJ-LJ2021（連江）、FJ-PC2021（浦城）、FJ-FQ2021（福清）、FJ-JY2021（建陽(yáng)）。

1.1.2 主要試劑 EasyPure Genomic DNA Kit、pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；CataAmp High Fidelity PCR Mix（北京開(kāi)拓思生物技術(shù)有限公司）；DNA Marker[寶生物（北京）工程有限公司]；凝膠回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank中收錄的NZ2株（No.DQ184476.1）FIL、B2L和GIF基因序列，利用Oligo 7.0軟件分別設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)表1，引物委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成 。

1.2.2 樣品處理 在生物安全柜中將每份嘴唇部痂皮用剪刀剪碎，按1∶5的體積比加入PBS研磨成漿，將研磨后的勻漿于-20 ℃冷凍保存。經(jīng)凍融3次后5 000 r·min-1離心15 min，取上清液備用。

1.2.3 核酸提取 按照北京全式金生物生物技術(shù)有限公司EasyPure Genomic DNA Kit說(shuō)明書(shū)分別提取上清液的DNA。

1.2.4 4份臨床樣品ORFVFIL、B2L和GIF基因擴(kuò)增高保真酶1-5TM2X High Fidelity Master Mix 10 μL，F(xiàn)1L、B2L和GIF基因上、下游引物（10 μmol·L-1)各 1 μL，1.2.3 中提取的 DNA 各 2 μL，RNase-Free H2O 補(bǔ)足 20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃熱變性 30 s，退火溫度分別按表1中的溫度30 s，72 ℃ 延伸 15 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 終延伸 7 min。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.5 4份臨床樣品ORFVFIL、B2L和GIF基因序列測(cè)定 目的片段經(jīng)膠回收后分別連接至pEASY?-Blunt Zero Cloning載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆并送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 4份臨床樣品ORFVFIL、B2L和GIF基因序列分析 序列經(jīng)拼接后上傳至GenBank，利用Lasergene.v7.1和MEGA7.0軟件分別對(duì)4份臨床樣品ORFVF1L、B2L和GIF基因的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中16株ORFV全基因序列和1株中國(guó)疫苗株B2L基因序列（表2）分別進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化分析樹(shù)。

表2 ORFV 參考毒株Table 2 Reference ORFV strains

2 結(jié)果與分析

2.1 4份臨床樣品中ORFV F1L基因核苷酸、推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分析

FJ-LJ2021（連 江 ）、 FJ-PC2021（浦 城 ）、 FJFQ2021（福 清 ）、 FJ-JY2021（建 陽(yáng) ）中 的 ORFVF1L基因序列已提交到GenBank，登錄號(hào)分別為ON093189、 ON093190、 ON093191 和 ON093192。MegAlian比對(duì)分析結(jié)果顯示4份臨床樣品中ORFV的F1L基因均由1 029個(gè)核苷酸組成，編碼343個(gè)氨基酸。4份臨床樣品中ORFVF1L基因核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為98.0%～98.8%和98.0%～99.1%；與國(guó)內(nèi)（NP、YX、GO、SJ1、CL18、SY17、NA17、GZ18、OV-HN3/12和 NA1/11）株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列的相似性分別為97.4%～99.4%和97.0%～99.7%；與國(guó)外（OV-SA00、0VIA82、TVL和MP）株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為97.5%～98.6%和96.7%～99.4%；與德國(guó)D1701弱毒株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為96.5%～96.8%和95.0%～96.2%，與NZ2參考株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為97.7%～98.1%和96.7%～97.9%。

2.2 4份臨床樣品中ORFV F1L基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

MEGA7.0構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示4份臨床樣品中的ORFV與福建（NP、YX、GO和SJ1）株、吉林CL18株、美國(guó)OV-SA00株及印度MP株處于同一進(jìn)化分支上，與吉林（NA17和GZ18）株、廣州（OV-HN3/12和 NA1/11）株、美國(guó)（OV-IA82和TVL）株和新西蘭NZ2參考株在相鄰分支上，親緣關(guān)系較近；與吉林SY17株和德國(guó)D1701弱毒株在不同分支上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖1）。

2.3 4份臨床樣品中ORFV B2L基因核苷酸、推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分析

FJ-LJ2021（連 江 ）、 FJ-PC2021（浦 城 ）、 FJFQ2021（福清）、FJ-JY2021（建陽(yáng)）中的ORFVB2L基因序列已提交到GenBank，登錄號(hào)分別為ON093185、ON093186、ON093187和 ON093188。MegAlian比對(duì)分析結(jié)果顯示4份臨床樣品中ORFV的B2L基因均由1 137個(gè)核苷酸組成，編碼379個(gè)氨基酸。4份臨床樣品中ORFVB2L基因核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為98.4%～99.5%和98.4%～99.7%；與國(guó)內(nèi)（NP、YX、GO、SJ1、CL18、SY17、NA17、GZ18、OV-HN3/12和NA1/11）株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列的相似性分別為97.4%～99.9%和97.9%～100%；與國(guó)外（OV-SA00、0VIA82和MP）株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為97.9%～98.9%和97.4%～98.9%；與德國(guó)D1701弱毒株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為98.0%～98.7%和98.1%～98.7%，與NZ2參考株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為97.5%～98.1%和97.6%～98.4%，與中國(guó)疫苗株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為97.7%～98.1%和97.4%～97.6%。

2.4 4份臨床樣品中ORFV B2L基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

MEGA7.0構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示4份臨床樣品中的ORFV分成3個(gè)分支，其中FJ-LY2021和FJ-PC2021與吉林（NA17和CL18）株處于同一進(jìn)化分支上，F(xiàn)J-FQ2021與福建SJ1株處于同一進(jìn)化分支上， FJ-LJ2021與吉林SY17株和印度MP株在同一進(jìn)化分支上；4份臨床樣品中的ORFV均與美國(guó)OVIA82株、新西蘭NZ2參考株和中國(guó)疫苗株在不同分支上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。

2.5 4份臨床樣品中ORFV GIF基因核苷酸、推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分析

FJ-LJ2021（連 江 ）、 FJ-PC2021（浦 城 ）、 FJFQ2021（福 清 ）、 FJ-JY2021（建 陽(yáng) ）中 的 ORFVGIF基因序列已提交到GenBank，登錄號(hào)分別為ON093181、 ON093182、 ON093183 和 ON073184。MegAlian比對(duì)分析結(jié)果顯示4份臨床樣品中ORFV的GIF基因均由798個(gè)核苷酸組成，編碼265個(gè)氨基酸。4份臨床樣品中ORFVGIF基因核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為97.2%～99.6%和97.7%～99.6%；與國(guó)內(nèi)（NP、YX、GO、SJ1、CL18、SY17、NA17、GZ18、OV-HN3/12和 NA1/11）株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列的相似性分別為95.7%～99.0%和94.7%～99.2%；與國(guó)外（OV-SA00、0VIA82和MP）株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為95.6%～98.0%和95.1%～98.9%；與德國(guó)D1701弱毒株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為96.0%～96.4%和88.7%～89.4%，與NZ2參考株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為95.9%～96.1%和95.1%～96.6%。

2.6 4份臨床樣品中ORFV GIF基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

MEGA7.0構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示4份臨床樣品中的ORFV均在同一分支上，與廣州GZ18株、吉林NA17株、福建（GO和YX）株、美國(guó)OV-SA00株和印度MP株處于同一進(jìn)化分支上，親緣關(guān)系較近；與吉林（CL18和SY17）株、廣州（OV-HN3/12和NA1/11）株、美國(guó)（OV-IA82和TVL）株和新西蘭NZ2參考株處于相鄰分支上，與德國(guó)D1701弱毒株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖3）。

3 討論與結(jié)論

由于Orf在綿羊和山羊中的發(fā)病率較低，在世界范圍內(nèi)普遍被忽視。早期研究數(shù)據(jù)表明福建省羊場(chǎng)該病的發(fā)病率為10.0%～72.0%，致死率為10.5%～20.0%[13-14]，近年來(lái)Orf的發(fā)病率和致死率相對(duì)較低，尚未引起福建省養(yǎng)殖企業(yè)的重視。然而由于該病存在人畜共患風(fēng)險(xiǎn)，且近年來(lái)關(guān)于人感染該病的報(bào)道時(shí)有發(fā)生[1-2,16]，為此，解析ORFV的遺傳變異情況對(duì)于福建省科學(xué)防控該病具有重要的理論依據(jù)。

已有的研究表明，ORFVB2L基因和F1L基因位于基因組的高度保守區(qū)域，通常作為檢測(cè)和構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)的首選基因[9,11,16-17]。本研究克隆了2021年福建省部分羊場(chǎng)ORFVB2L和F1L基因，獲得的序列上傳至GenBank中，得到了相應(yīng)序列號(hào)，同時(shí)與當(dāng)前GenBank中收錄的國(guó)內(nèi)外16株ORFV全基因組進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示4份臨床樣品中ORFV的F1L基因核苷酸序列相似性為98.0%～98.8%；與國(guó)內(nèi)流行毒株核苷酸序列相似性為97.4%～99.4%；與國(guó)外流行毒株核苷酸序列相似性為97.5%～98.6%；與德國(guó)D1701弱毒株核苷酸序列相似性為96.5%～96.8%，與NZ2參考株核苷酸序列相似性分別為97.7%～98.1%。遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示FJ-LY2021與福建（NP、YX和GO）株親緣關(guān)系較近，F(xiàn)J-FQ2021與吉林GZ18株親緣關(guān)系較近，F(xiàn)JLJ2021與福建SJ1株親緣關(guān)系較近，F(xiàn)J-PC2021株與印度MP親緣關(guān)系較近；4份臨床樣品中ORFV均與吉林SY17株和德國(guó)D1701弱毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。4份臨床樣品中ORFVB2L基因核苷酸序列相似性為98.4%～99.5%；與國(guó)內(nèi)流行毒株核苷酸序列的相似性為97.4%～99.9%；與國(guó)外流行株核苷酸序列相似性為97.9%～98.9%；與德國(guó)D1701弱毒株核苷酸序列相似性為98.0%～98.7%，與NZ2參考株核苷酸相似性為97.5%～98.1%，與中國(guó)疫苗株核苷酸序列相似性為97.7%～98.1%。遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示FJLY2021和FJ-PC2021與吉林（NA17和CL18）株親緣關(guān)系較近，F(xiàn)J-FQ2021與福建SJ1株親緣關(guān)系較近，F(xiàn)J-LJ2021與吉林SY17株和印度MP株親緣關(guān)系較近；4份臨床樣品中ORFV均與美國(guó)OV-IA82株、新西蘭NZ2參考株和中國(guó)疫苗株在不同分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由此可見(jiàn)，2021年福建省部分羊場(chǎng)ORFV流行情況較為復(fù)雜，祖先來(lái)源多元化，有本省毒株、國(guó)內(nèi)吉林GZ18株和國(guó)外印度MP株，間接證明了當(dāng)前疫苗不能很好地保護(hù)Orf的發(fā)生，將增加Orf的防控壓力。Wang等[16]分析了2018年安徽省ORFV分離株F1L和B2L基因遺傳特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)安徽省ORFV流行株是由山東和臺(tái)灣南投流行株基因重組而形成的新毒株；Ahanger等[17]分析了克什米爾喜馬拉雅地區(qū)ORFVB2L和VIR基遺傳特征，結(jié)果顯示當(dāng)?shù)亓餍械腛RFV綿羊分離株與希臘和意大利的綿羊分離株具有高度同源性，而ORFV山羊分離毒株與中國(guó)的山羊分離株具有高度的同源性。以上研究者的結(jié)論與本研究相一致，ORFV今后流行的毒株將會(huì)是基因重組毒株為主。

針對(duì) ORFV毒力相關(guān)基因的分析有利于解析不同ORFV 毒株間致病性的差異，而且相關(guān)毒力基因的發(fā)現(xiàn)可為ORFV 基因缺失苗的構(gòu)建及弱毒疫苗的制備提供重要的理論依據(jù)。GIF是ORFV117基因編碼產(chǎn)生，它是病毒感染后中晚期表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)蛋白的毒力基因之一[12]。本研究中4份臨床樣品中ORFV的GIF基因均由798個(gè)核苷酸組成，編碼265個(gè)氨基酸。4份臨床樣品中ORFVGIF基因核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為97.2%～99.6%和97.7%～99.6%；與國(guó)內(nèi)（NP、YX、GO、SJ1、CL18、SY17、NA17、GZ18、OV-HN3/12 和NA1/11）株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列的相似性分別為95.7%～99.0%和94.7%～99.2%；與國(guó)外（OV-SA00、0VIA82和MP）株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為95.6%～98.0%和95.1%～98.9%；與德國(guó)D1701弱毒株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為96.0%～96.4%和88.7%～89.4%，與NZ2參考株核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為95.9%～96.1%和95.1%～96.6%。遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示4份臨床樣品中的ORFV毒株均在同一分支上，與廣州（GZ18）株、吉林NA17株、福建（GO和YX）株、美國(guó)OV-SA00株和印度MP株處于同一進(jìn)化分支上，親緣關(guān)系較近；與吉林（CL18和SY17）株、廣州（OV-HN3/12 和NA1/11）株、美國(guó)（OVIA82和TVL）株和新西蘭NZ2參考株處于相鄰分支上，與德國(guó)D1701弱毒株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，處于不同進(jìn)化分支上。

綜上所述，本研究獲得了4份臨床樣品中ORFVB2L、F1L和GIF基因序列并將序列上傳至GenBank中，豐富了ORFV相關(guān)基因序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，闡明了福建省部分羊場(chǎng)當(dāng)前ORFV的分子流行特征，為福建省今后有效防控Orf提供了理論依據(jù)。