徐思琪，張世勇 ，張文平，劉洪巖，王明華，鐘立強，邊文冀,3，陳校輝,3

（1.江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017；2.江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省農業(yè)種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014）

0 引 言

【研究意義】斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus），屬鯰形目（Siluriformes）鮰科（Ictaluridae），原產于北美，是美國最主要的淡水養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖產量占美國魚類養(yǎng)殖產量的60%以上[1]。自1984年我國首次從美國引種，經過三十多年的發(fā)展，在廣東、河南、江蘇、湖北、四川等省份形成較大的養(yǎng)殖規(guī)模。隨著我國斑點叉尾鮰市場需求量的不斷擴大，其養(yǎng)殖產量呈逐年遞增的趨勢。自2013年起，我國的斑點叉尾鮰養(yǎng)殖產量超越美國，成為世界最大的斑點叉尾鮰養(yǎng)殖和消費國家[2]。相較于斑點叉尾鮰雄魚，雌魚生長較為緩慢，且較大的卵巢組織一定程度上降低了其可食用比例，因此雄魚在流通市場上更受歡迎。性別二態(tài)性是自然界中的常見現象。在魚類中，大多數種類由于存在生長、性成熟年齡、體型、體色等性別二態(tài)性現象，使得其中的一種性別具有更大的經濟價值，雌雄個體經濟價值的不同在一定程度上制約了其產業(yè)的發(fā)展。因此，越來越多的育種工作者開始探索性別控制育種，培育具有更大經濟價值的單性品種。在斑點叉尾鮰全雄魚的選育過程中，獲得穩(wěn)定遺傳的XY偽雌魚是最為核心的環(huán)節(jié)。為此，課題組以培育斑點叉尾鮰全雄品種為目標，著力開展溫度誘導其XY型雄魚雌性化研究。在偽雌魚性成熟后，通過與正常雄魚雜交或采用雌核發(fā)育策略獲得YY型超雄魚，超雄魚再與正常雌魚雜交即可培育出全雄魚?！厩叭搜芯窟M展】大量研究表明溫度的升高或降低可以誘導硬骨魚類雌性化或雄性化。遺傳性別為雌性的奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）[3]在高溫誘導后生理性別向雄性方向逆轉，在大鱗副泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[4]、斑馬魚（Danio rerio）[5]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[6]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[7]、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[8]等也發(fā)現高溫可使雄性率升高的現象。銀漢魚（Menidia beryllina）[9]在低溫條件下雌性率可達85%。在小黃魚（Larimichthys polyactis）[10]養(yǎng)殖過程中發(fā)現，溫度升高能使小黃魚性腺分化速率加快，同時小黃魚的生理性別為雌性的比例升高。在少量的魚類中，也觀察到高溫誘導雄性向雌性逆轉的現象，高溫促使鯽魚（Carassius auratus）[11]、許氏平鲉（Sebastes schlegeli）[12]、江黃顙魚（Pseudobagrus vachelli）[13]等的生理性別向雌性化方向分化?！颈狙芯壳腥朦c】在上述研究基礎上，本項目組前期試驗發(fā)現在斑點叉尾鮰中通過提高溫度能夠使其性腺向雌性化方向分化發(fā)育，這為斑點叉尾鮰的性控制研究提供了新的思路。斑點叉尾鮰的卵巢分化起始于受精后的第19 d，而精巢的分化晚于卵巢，一般在受精后的第90～102 d開始[14]。在斑點叉尾鮰的卵黃囊苗時期提高養(yǎng)殖水體溫度，可以誘導斑點叉尾鮰向雌性化方向分化。【擬解決的關鍵問題】本試驗通過比較不同溫度處理組生長數據，并利用組織學切片技術觀察其性腺分化與發(fā)育情況；同時，采用qRT-PCR方法分別檢測雄性性別標志基因dmrt1 基因和雌性性別標志基因 foxl2 基因在 XX 和XY偽雌魚卵巢中的表達水平，探究溫度對斑點叉尾鮰生長及性腺分化的影響及不同溫度對性腺分化影響的潛在機制，為闡明溫度影響斑點叉尾鮰分化機制奠定基礎，同時為日后建立環(huán)境友好型的斑點叉尾鮰性別控制育種模式提供前期探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所選用的斑點叉尾鮰親魚來自國家級江蘇斑點叉尾鮰遺傳育種中心。健康親魚交配產卵后，選取發(fā)育成熟、活力旺盛的卵黃囊苗，在斑點叉尾鮰魚卵流水孵化裝置中孵化出苗。設置（30±0.5） ℃（T-30，CK）、（33±0.5） ℃ （T-33）和（36±0.5） ℃（T-36） 3個溫度組，初始水溫為28 ℃，使用加熱棒每隔12 h升溫1 ℃，至水溫到達設定溫度后持續(xù)保持溫度恒定。每個試驗組設置3個重復，每個重復放置800尾魚苗（規(guī)格：52 尾·g-1），從1 dah斑點叉尾鮰的培育開始，進行為期30 d的溫度誘導試驗。待卵黃囊褪去，仔魚上游覓食后，先投喂開口餌料，然后投喂微粒飼料（粗蛋白≥50%，粗脂肪≥8%，粗纖維≤3%，粗灰分≤16.5%，鈣≤5%，總磷≥1%，水分≤12%，賴氨酸≥2%）（山東升索飼料科技有限公司），根據試驗魚的生長情況制定的開口餌料及微粒飼料調整方案如表1所示。結束30 d的溫度誘導后將30日齡試驗魚移至室外水泥池（5 m×5 m×1 m）進行養(yǎng)殖，飼料更換為商品飼料（粗蛋白≥30%，水分≤12%，粗纖維≤10%，粗灰分≤13%，粗脂肪≥3%，總磷≥1%，賴氨酸≥1.5%）（南京市澳華生物科技有限公司）。每日上、下午各投喂一次，日投喂量為魚體重的3%。

表1 開口餌料及微粒飼料調整方案Table 1 Particulate feed adjustment for channel catfish

1.2 生長數據采集

在60日齡時，采用-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽（MS-222）（Merck，德國）浸潤麻醉，統(tǒng)計各組中試驗魚的存活情況，從各試驗組中隨機選取100尾試驗魚，測量試驗魚的體長、體重生長數據。

1.3 遺傳性別鑒定

在60日齡時，從各試驗組中隨機選取20尾試驗魚，剪取試驗魚的尾鰭后，將其保存在無水乙醇中，用于遺傳性別鑒定。取10～20 mg的尾鰭組織，擦干剪碎后放置于1.5 mL離心管中?；蚪MDNA的提取采用DNA Isolation Mini Kit試劑盒（南京諾維贊生物科技有限公司），提取過程嚴格按照說明書進行，提取完成的基因組DNA樣本存放于-20 ℃冰箱中保存。采用課題組前期開發(fā)的斑點叉尾鮰遺傳性別鑒定方法[15]對試驗魚的遺傳性別進行鑒定。

1.4 解剖學觀察

在60日齡時，從各試驗組中隨機采集100尾試驗魚，麻醉后割斷鰓蓋與腮絲間的動脈，血液放干后在試驗魚的肛門處做縱向切口，根據試驗魚規(guī)格調整切口長度（約3～4 cm），觀察試驗魚卵巢形成情況。同時，采集試驗魚的尾鰭組織，提取DNA后鑒定遺傳性別。根據鑒定結果統(tǒng)計各組中試驗魚的卵巢形成比例和性逆轉率（XY偽雌魚/XY雄魚×100%）。

1.5 組織學觀察

取性腺保存在多聚甲醛溶液中，用于組織切片。性腺組織中的蛋白質經多聚甲醛保存后變性凝固，用低濃度到高濃度的酒精脫去性腺組織中的水分，置于二甲苯中透明后浸入融化的石蠟中，待石蠟浸入完全后進行包埋冷卻。制作5～6 μm的切片，采用HE染色，最后滴上樹膠封固[16]。在光學顯微鏡（Nikon，日本）下觀察并拍照記錄各試驗組中性腺形成情況，在組織學水平觀察T-30組中正常雌魚，T-33組、T-36組中XY雌魚的性腺發(fā)育情況。

1.6 性別分化相關基因表達分析

采用qRT-PCR方法檢測T-30組、T-36組雌雄性腺中foxl2和dmrt1基因mRNA的相對表達量。采集150日齡T-30組雌雄試驗魚的精巢、卵巢組織，T-36組正常雌魚和XY雌魚的卵巢組織后，使用RNA提取試劑盒（Qiagen，德國）提取總RNA，該過程嚴格按照說明書進行。使用Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒（TaKaRa，日本）合成cDNA，cDNA合成后存放于-80 ℃冰箱。應用NCBI中Primer-BLAST功能設計斑點叉尾鮰foxl2和dmrt1基因編碼區(qū)的qRTPCR反應引物，內參基因為α-tubulin[17]，qRT-PCR反應引物如表2所示。qRT-PCR體系為 25 μL，包括12.5 μL TB Green 染 料 （Takara， 日 本 ）， 2 μL cDNA，上下游引物各 1 μL，5 μL H2O。qRT-PCR 程序為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，79 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s，每個試驗 3 次重復。采用 2-△△CT值法[18]計算foxl2和dmrt1基因在正常XX雌魚、XY雌魚卵巢中的相對表達量。

表2 qRT-PCR反應引物表Table 2 Primers for q-PCR

1.7 數據分析

使用Excel軟件統(tǒng)計生長、存活率和性逆轉率等數據，試驗數據以“平均值±標準差 （X ±SD） ”表示，采用R 4.0.5軟件對所有試驗數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 溫度對斑點叉尾鮰生長及性逆轉的影響

統(tǒng)計T-30組、T-33組和T-36組60日齡試驗魚的生長情況及卵巢形成情況發(fā)現（表3），溫度越高，試驗魚的存活率越低，當溫度達到36 ℃時，試驗魚的存活率僅為82.67%，與其他兩組呈顯著性差異（P＜0.05）。T-33組試驗魚的體長、體重均為3組中最高，T-36組試驗魚的體長、體重均為3組中最低，但是3組處理之間的生長數據無顯著性差異（P＞0.05）。T-30組卵巢形成比例為51%，雌雄魚比例接近1:1，隨著溫度的提高，試驗魚的卵巢形成比例逐漸提高，性逆轉率與溫度呈正相關。各組在卵巢形成比例和性逆轉率均呈顯著性差異（P＜0.05）。

表3 試驗魚生長特性和雌魚比例Table 3 Growth and survival of channel catfish and proportion of females in each experimental group

2.2 性逆轉效果評估

性逆轉效果評估是在鑒定試驗魚遺傳性別后，根據組織學觀察和解剖學觀察綜合分析XY雌魚卵巢發(fā)育情況（圖1）。選取T-30、T-33組、T-36組XX雌魚和T-33組、T-36組XY偽雌魚的卵巢組織進行對比分析，結果發(fā)現各組的卵母細胞均呈圓形，都以Ⅱ期卵母細胞為主，T-30組XX雌魚的部分卵母細胞發(fā)育至Ⅲ期卵母細胞，而T-33組、T-36組中XX雌魚的卵母細胞以Ⅲ期卵母細胞為主，T-36組XY偽雌魚中存在少量Ⅲ期卵母細胞，而T-33組XY偽雌魚中未見明顯的Ⅲ期卵母細胞。T-33組和T-36組XY偽雌魚的卵母細胞數量少于XX雌魚，且細胞內以1～2個核仁的卵母細胞為主，T-30組、T-33組和T-36組的卵母細胞核內主要分布3個以上核仁。

通過解剖學觀察發(fā)現，T-30組、T-33組和T-36組之間卵巢發(fā)育無異，T-36組中XY雌魚的卵巢發(fā)育正常，但T-33組中XY雌魚的卵巢發(fā)育緩慢，卵巢纖細，且與體腔黏膜相連，輪廓不清晰。

2.3 溫度對性別分化相關基因表達量的影響

對150日齡T-30組中雌魚、雄魚的卵巢和精巢組織，以及T-36組中XY偽雌魚和XX雌魚卵巢組織提取總mRNA后，通過qRT-PCR方法檢測雄性性別決定基因dmrt1和雌性性別決定基因foxl2在上述組織中的相對表達量（圖2）。結果顯示，dmrt1基因在正常雄魚的精巢中的表達量最高，與T-30、T-36組中雌魚的卵巢組織的表達量呈顯著差異（P＜0.05），與T-36組中XY偽雌魚的卵巢組織無顯著性差異。foxl2基因在T-36組XY雌魚中被激活，與T-36組雌魚，T-30組正常雌魚、雄魚的性腺組織呈顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

硬骨魚的性別分化和形成由遺傳因素和環(huán)境因素共同決定，環(huán)境因素包括溫度[19]、pH值[20]、光周期[21]、溶解氧[22]、種群密度[23]等，具有很強的可塑性[24]。其中，溫度是影響硬骨魚性別分化的最重要環(huán)境因子[25]。高溫時，硬骨魚的性別決定出現溫度依賴型，即溫度閾值達到34 ℃時，硬骨魚的性別分化向雌性或雄性的方向逆轉[26]。硬骨魚發(fā)育早期，高溫通過改變體內芳香化酶活性，導致雌雄魚體內分泌的雌二醇、睪酮等相關性激素含量出現差異，最終改變原有的性別分化方向[27]。在已報道的大部分硬骨魚類中，高溫通常誘導其性別比例偏向于雄性[28]，本試驗中斑點叉尾鮰在高溫誘導下性腺向雌性化方向分化，與鯽魚[11]、許氏平鲉[12]等分化方向相同。

研究表明，對于廣溫性魚類和暖水性魚類而言，當養(yǎng)殖水體溫度超過最適水體溫度時，其代謝加快，餌料系數降低，魚體生長減慢[29]。但是不同魚類適宜的養(yǎng)殖水體溫度略有差異，劉鑒毅等[30]研究表明，當水溫在19～31 ℃時，斑點叉尾鮰的特定生長率（SGR）和相對增重率（WGR）與溫度呈正相關，并基于研究推斷31 ℃并未達到斑點叉尾鮰的最適生長溫度。在本試驗中，T-33組試驗魚的生長數據最佳，這可能與33 ℃更貼近斑點叉尾鮰的最適生長溫度有關。

foxl2和dmrt1基因被認為是硬骨魚類雌雄性別分化的標志基因，其在性別決定和分化中互為拮抗作用，foxl2基因對卵巢的分化和促進卵母細胞的發(fā)育有著重要作用，而dmrt1基因主要參與雄性的性別決定和精巢的分化，抑制卵母細胞發(fā)育[31]。foxl2和dmrt1基因通過調控cyp19a1、sox9等下游性別分化相關基因的表達，使雌雄硬骨魚體內雌二醇和睪酮等類固醇激素含量出現差異[32,33]，從而達到調控雌雄性別分化的目的。研究發(fā)現，dmrt1基因對雄性斑馬魚的性腺維持起著重要作用，dmrt1基因的突變會導致雄性斑馬魚性逆轉為可育雌性[34]；使用CRISPR/Cas9技術敲除異育銀鯽（Carassius gibelio）foxl2基因，導致其卵母細胞發(fā)育緩慢甚至發(fā)生性逆轉[35]。

在本研究中，foxl2基因在XY偽雌魚卵巢中的表達量顯著高于其他3個組織，造成這一現象的可能原因是高溫通過上調XY偽雌魚foxl2基因的表達實現其性別逆轉。然而，XY偽雌魚的dmrt1基因在卵巢中的表達量僅低于正常雄魚精巢，其表達并沒有完全被抑制。類似的現象也見于17β-雌二醇誘導尖吻鱸（Lates calcarifer）性逆轉的研究中，其性逆轉魚卵巢中foxl2基因的表達量顯著上調，但dmrt1基因的表達未被完全抑制[36]。因此，推測即使XY雌性斑點叉尾鮰dmrt1基因雖未被完全抑制，但是受高表達foxl2基因的影響，其性腺仍舊會發(fā)育成卵巢。然而，高溫誘導解除后，其性腺是否會向精巢分化仍有待于進一步研究。