何紫晨,胡雪峰,陸思文,趙景龍,蘭國(guó)俊,李梅,張偉杰

(上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,上海 200444)

隨著城市化進(jìn)程加快,道路交通越來(lái)越發(fā)達(dá),機(jī)動(dòng)車數(shù)量逐年增多,對(duì)石油的開采和使用量也越來(lái)越大.在采油、煉油、運(yùn)輸和使用過(guò)程中,石油難免會(huì)滴漏在附近土壤上造成污染[1].柴油是一種常見的石油產(chǎn)品,是由烷烴、環(huán)烷烴、烯烴和一環(huán)至多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)組成的一種復(fù)雜化合物[2].此外,受工礦業(yè)三廢排放、大氣沉降以及農(nóng)業(yè)面源污染等影響,土壤還會(huì)受到重金屬污染,如重金屬鎘[3].2014年4月,全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)顯示,全國(guó)土壤各種污染物總超標(biāo)率為16.1%,其中石油烴和PAHs污染土壤的超標(biāo)率達(dá)23.6%,土壤鎘超標(biāo)率達(dá)7%,土壤質(zhì)量不容樂觀[4].

柴油等石油類污染物進(jìn)入土壤后,會(huì)堵塞土壤孔隙,大大降低土壤的透氣性和透水性,使土壤微生物群落發(fā)生變化,破壞土壤微生態(tài)環(huán)境[5].土壤鎘污染的危害主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面:鎘在農(nóng)作物中富集,并隨食物鏈進(jìn)入人體;鎘通過(guò)地表徑流進(jìn)入天然水體,在魚類體內(nèi)富集,并經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體.進(jìn)入人體內(nèi)的鎘在積累到一定量后會(huì)對(duì)人體造成一系列的危害[6].

土壤酶是土壤的重要組分,主要由土壤微生物分泌產(chǎn)生[7].土壤酶分為胞內(nèi)酶和胞外酶,是一類具有催化能力的生物活性物質(zhì)[8],能夠提高土壤的物質(zhì)傳遞和能量轉(zhuǎn)換效率,與土壤養(yǎng)分的有效利用息息相關(guān)[9].土壤酶活性對(duì)土地利用方式的改變、土壤有機(jī)質(zhì),以及其他土壤性質(zhì)的變化十分敏感[10].土壤酶活性能夠反映土壤中所進(jìn)行的各種生物化學(xué)過(guò)程的方向和強(qiáng)度[11],因此可作為反映土壤質(zhì)量的敏感指標(biāo)[12].已有研究表明,土壤酶活性會(huì)受到柴油和重金屬污染的影響[1,13],但實(shí)驗(yàn)結(jié)果常有差異.上海地區(qū)工業(yè)發(fā)達(dá),部分土壤受到油類和重金屬污染,因此進(jìn)一步研究土壤酶活性對(duì)油類和重金屬污染的響應(yīng)十分重要.本工作通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn),研究了不同濃度的柴油污染、鎘污染以及柴油+鎘復(fù)合污染對(duì)土壤酶活性及微生物數(shù)量的影響,為進(jìn)一步分析不同土壤污染下的微生物生態(tài)效應(yīng)提供了依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)土壤采自上海市青浦區(qū)金澤鎮(zhèn)沙崗村“教授農(nóng)場(chǎng)”(31°7′22.47′′N,120°52′56′′E).該處土壤無(wú)明顯工業(yè)污染源,且經(jīng)過(guò)了7年有機(jī)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化管理.采集耕作層(0～20 cm)土壤,自然風(fēng)干后,磨細(xì),過(guò)10目土壤篩.實(shí)驗(yàn)用0號(hào)柴油購(gòu)自上海大學(xué)寶山校區(qū)附近加油站.實(shí)驗(yàn)用氯化鎘(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司.實(shí)驗(yàn)用番茄苗為自主培育1個(gè)月的幼苗,品種為黃金番茄.實(shí)驗(yàn)土壤的基本理化性狀和土壤顆粒組成的測(cè)定參照《土壤調(diào)查實(shí)驗(yàn)室分析方法》[14],結(jié)果如表1和2所示.

表1 盆栽實(shí)驗(yàn)所用土壤的基本理化性狀Table 1 Physical-chemical properties of the soil used for the pot experiment

表2 土壤顆粒組成和質(zhì)地名稱Table 2 Soil particle composition and texture name

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

梁小翠等[15]利用市售0號(hào)柴油,分別設(shè)置低質(zhì)量比2 g/kg、中質(zhì)量比10 g/kg、高質(zhì)量比50 g/kg,模擬了PAHs污染對(duì)土壤酶活性的影響.沈秋悅等[16]分別設(shè)置鎘質(zhì)量比為1.0、5.0、10.0、30.0 mg/kg對(duì)土壤進(jìn)行處理,研究了鎘污染對(duì)土壤微生物活性的影響.本實(shí)驗(yàn)借鑒大量前人工作,共設(shè)置7個(gè)處理組,分別為對(duì)照(CK)、低量柴油(CYL)、高量柴油(CYH)、低量鎘(CdL)、高量鎘(CdH)、高量柴油+高量鎘(CYH+CdH)和高量柴油+高量鎘+種植番茄苗(CYH+CdH+P)(見表3),每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù).2019年8月22日,將事先均勻磨細(xì)并過(guò)2 mm篩子的土壤裝入高11.5 cm、內(nèi)徑13.5 cm的花盆中,并按不同處理劑量(見表3)均勻拌入柴油或氯化鎘溶液.模擬實(shí)驗(yàn)污染物加入土壤后,通常需要一定時(shí)間的穩(wěn)定老化.梁小翠等[15]在研究柴油對(duì)土壤酶活性的影響時(shí),將柴油和土壤充分拌勻后穩(wěn)定了48 h.楊惠芳等[17]在研究單甲脒農(nóng)藥對(duì)土壤微生物和酶活性的影響時(shí),于噴灑農(nóng)藥后的第2天才開始實(shí)驗(yàn).本實(shí)驗(yàn)借鑒前人經(jīng)驗(yàn),待污染物與土壤穩(wěn)定一夜后,于次日早上,采集第一批土壤鮮樣.之后每隔一周采集一次,測(cè)試土壤酶活性和微生物數(shù)量.

表3 盆栽實(shí)驗(yàn)的不同處理設(shè)置Table 3 Different treatments of the pot experiment

1.3 土壤脲酶和脫氫酶活性的測(cè)試

土壤酶活性的測(cè)試方法參考了《土壤酶及其研究法》[18].采用苯酚鈉比色法檢測(cè)土壤脲酶活性,以24 h后100 g干土中NH3-N的mg數(shù)表示.采用三苯基氯代四氮唑(triphenytetrazoliumchloride,TTC)還原法檢測(cè)土壤脫氫酶活性,以24 h后1 g干土中產(chǎn)生三苯基甲(triphenyl formazan,TPF,TTC的還原性產(chǎn)物)的μg數(shù)表示.每一批土樣采用重量法檢測(cè)其含水率.

1.4 土壤微生物的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

土壤微生物的檢測(cè)采用稀釋涂布平板法[19].用無(wú)菌水將土壤鮮樣稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4,10-55個(gè)梯度.用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌.對(duì)培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù),計(jì)算出每克干土中這3種微生物的數(shù)量.

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器

本實(shí)驗(yàn)使用儀器有721G型可見分光光度計(jì)、PHS-3C型pH計(jì)、生化培養(yǎng)箱.

1.6 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2016處理,差異性和相關(guān)性分析通過(guò)IBM SPSS Statistics 24實(shí)現(xiàn),柱狀圖用Origin Pro 2017C 64Bit繪制.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同處理下的土壤脲酶活性

盆栽實(shí)驗(yàn)所得土壤脲酶活性的變化結(jié)果如圖1所示,其中柱狀數(shù)據(jù)標(biāo)注相同字母的兩個(gè)數(shù)據(jù)不存在顯著差異(p＞0.05);標(biāo)注不同字母的兩個(gè)數(shù)據(jù)存在顯著差異(p＜0.05),下同.可以看出:在實(shí)驗(yàn)的第8天,CYH和CYH+CdH+P處理組的土壤脲酶活性顯著高于CK和其他處理組(p＜0.05);在第15天,CYH處理組顯著高于CK組(p＜0.05),但與CYH+CdH和CYH+CdH+P處理組無(wú)顯著差異(p＞0.05);在第22天,CYH+CdH+P處理組顯著高于CK組(p＜0.05),但與CYH和CYH+CdH處理組無(wú)顯著差異(p＞0.05).總的來(lái)看,CYH、CYH+CdH和CYH+CdH+P處理組的土壤脲酶活性明顯高于CK和其他處理組;在實(shí)驗(yàn)期,CYH處理組平均分別是CK組的1.14倍、5.25倍、3.77倍和2.18倍,CYH+CdH處理組分別是CK組的1.50倍、1.62倍、2.63倍和2.53倍,CYH+CdH+P處理組分別是CK組的1.42倍、5.24倍、2.36倍和3.46倍.

圖1 不同處理下的土壤脲酶活性Fig.1 Urease activity of the soil for the different treatments

在實(shí)驗(yàn)開始的第1天,CdL和CdH處理組的土壤脲酶活性低于CK組;但在隨后的實(shí)驗(yàn)期,CdL、CdH和CYL處理組的土壤脲酶活性始終與CK組接近,無(wú)顯著差異(p＞0.05).

2.2 不同處理下的土壤脫氫酶活性

盆栽實(shí)驗(yàn)所得到的土壤脫氫酶的活性變化,與土壤脲酶活性有很大差異,結(jié)果如圖2所示.可見:在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期,CYL、CYH、CYH+CdH和CYH+CdH+P處理組的土壤脫氫酶活性多顯著低于CK組(p＜0.05);在第15天,CYL和CYH+CdH+P處理組的土壤脫氫酶活性低于CK組,但未達(dá)顯著差異水平(p＞0.05);CYL處理組的土壤脫氫酶活性多高于CYH、CYH+CdH、CYH+CdH+P處理組,且在實(shí)驗(yàn)的第1天和第22天,顯著高于CYH和CYH+CdH組(p＜0.05);在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期,CYH+CdH+P處理組的土壤脫氫酶活性均高于CYH和CYH+CdH處理組,但未達(dá)到顯著差異(p＞0.05).

圖2 不同處理下的土壤脫氫酶活性Fig.2 Dehydrogenase activity of the soil for the different treatments

在實(shí)驗(yàn)的第1～15天,CdL處理組的土壤脫氫酶活性基本與CK組相近;但在第8天,CdL處理組的土壤脫氫酶活性顯著高于CK和CdH處理組(p＜0.05);在第15天,CdL處理組的土壤脫氫酶活性顯著低于CdH處理組(p＜0.05),且在實(shí)驗(yàn)第22天顯著低于CK組;在第15天和第22天,CdL處理組的脫氫酶活性分別為CK組的95%和49%,CdH處理組的活性分別只有CK組的42%和65%;除第15天外,CdL和CdH處理組的土壤脫氫酶活性均顯著高于CYH和CYH+CdH處理組(p＜0.05).

2.3 不同處理下的土壤微生物種群和數(shù)量

盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),對(duì)土壤微生物種群和數(shù)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3所示.可以看出:不同處理組的土壤微生物種群數(shù)量特征有較相似的變化趨勢(shì);土壤細(xì)菌數(shù)量最多,占微生物總數(shù)的79.28%～99.19%;放線菌數(shù)量次之,占微生物總數(shù)的0.76%～19.54%;真菌數(shù)量最少,占微生物總數(shù)的0.06～1.38%.

圖3 不同處理下的土壤微生物種群和數(shù)量Fig.3 Types and numbers of microbes in the soil for the different treatments

CYH和CYH+CdH處理組的土壤細(xì)菌數(shù)量高于CK和其他處理組,且CYH+CdH處理組與CK組差異性顯著(p＜0.05).CdL、CdH和CYH+CdH+P處理組的細(xì)菌數(shù)量與CK組接近.CYH處理組的土壤放線菌數(shù)量顯著高于CK和其他處理組.CYL和CYH處理組的土壤真菌數(shù)量高于CK和其他處理組,其中CYH處理組的土壤真菌數(shù)量顯著高于CK和其他處理組(p＜0.05).這表明柴油的添加,尤其是高量柴油的添加,對(duì)各類微生物均有一定的激活效應(yīng).這與柴油處理(見CYL和CYH處理組)后土壤脲酶活性的增加相對(duì)應(yīng),但對(duì)真核微生物的效應(yīng)不明顯.鎘的添加(見CdL和CdH處理組)對(duì)放線菌有一定的抑制效應(yīng).但總體來(lái)看,柴油與鎘對(duì)各類微生物的影響均未達(dá)到顯著效應(yīng).

3 討論

脲酶是一種微生物細(xì)胞外的酰胺酶[20],參與土壤中的氮素循環(huán).它將有機(jī)氮化合物轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)氮,如將尿素降解成氨[21],供植物利用.姜必亮等[22]在研究含較高濃度有機(jī)物、重金屬離子的垃圾滲濾液時(shí)發(fā)現(xiàn),土壤脲酶對(duì)其反應(yīng)敏感.他們將鎘質(zhì)量濃度為0.011 mg/L的垃圾滲濾液稀釋50%后用于灌溉,發(fā)現(xiàn)土壤和黏土的脲酶活性均顯著增強(qiáng).Dindar等[23]在研究石油烴污染土壤中酶活性的變化時(shí)發(fā)現(xiàn),廢機(jī)油和原油污染土壤中的酶活性整體高于對(duì)照組.沈國(guó)清等[24]的研究也表明:在實(shí)驗(yàn)第49天,重金屬和多環(huán)芳烴復(fù)合污染的土壤脲酶活性被激活;當(dāng)Cd質(zhì)量比為12.8 mg/kg,菲、熒蒽、苯并[a]芘的質(zhì)量比均為0.8 mg/kg時(shí),脲酶活性提高了115.6%;當(dāng)鎘質(zhì)量比為0.8 mg/kg,菲、熒蒽、苯并[a]芘的質(zhì)量比均為0.2 mg/kg時(shí),脲酶活性提高了150.4%.柴油中常見的多環(huán)芳烴為菲、熒蒽、苯并[a]芘等[25],這與本實(shí)驗(yàn)中柴油或柴油+鎘復(fù)合污染刺激土壤脲酶活性增加的結(jié)果十分相似.在本實(shí)驗(yàn)中,CYH、CYH+Cd和CYH+Cd+P處理組的土壤脲酶活性多顯著高于CK組(p＜0.05,見圖1).這說(shuō)明土壤柴油和柴油+鎘復(fù)合污染不僅不能抑制脲酶活性,反而刺激了脲酶活性的增加.此外,CYL處理組的土壤脲酶活性始終低于CYH、CYH+CdH和CYH+CdH+P處理組.這說(shuō)明柴油污染量大,反而有利于脲酶活性的增加.

在實(shí)驗(yàn)第1天,CdH和CdL處理組的土壤脲酶活性顯著低于CK和其他處理組.這顯然是由于土壤受鎘毒害影響,抑制了脲酶活性.但在隨后的不同階段,不同質(zhì)量濃度的鎘對(duì)土壤脲酶活性不再產(chǎn)生顯著影響.這說(shuō)明土壤脲酶對(duì)鎘的毒害有一定的抗性.沈國(guó)清等[24]的研究發(fā)現(xiàn),鎘+菲復(fù)合污染對(duì)土壤脲酶活性表現(xiàn)為協(xié)同作用,且除了鋅和苯并[a]芘之間表現(xiàn)為拮抗作用外,多環(huán)芳烴無(wú)論是單污染還是與重金屬?gòu)?fù)合污染,均對(duì)土壤酶活性有激活作用.在本實(shí)驗(yàn)中后期,CYH+CdH處理組的土壤脲酶活性不斷升高,最后甚至高于CYH處理組.這表明柴油和鎘復(fù)合污染對(duì)土壤脲酶活性反而有更好的促進(jìn)效應(yīng).在實(shí)驗(yàn)中期(第8天),CYH+CdH+P處理組的土壤脲酶活性接近CYH處理組,顯著高于其他處理組(p＜0.05);隨后有所下降,并在實(shí)驗(yàn)后期,高于其他處理組.這說(shuō)明在污染土壤栽種作物能有效緩解毒害,增加脲酶活性.

脫氫酶是土壤微生物呼吸作用的主要酶[26],能活化被氧化有機(jī)物的氫原子并傳遞給特定的受氫體[27].在本實(shí)驗(yàn)中,柴油和鎘對(duì)土壤脫氫酶活性的影響與脲酶完全不同.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期,柴油(CYL、CYH)和柴油+鎘(CYH+CdH、CYH+CdH+P)處理組的土壤脫氫酶活性均顯著低于CK組(p＜0.05).這表明柴油和柴油+鎘復(fù)合污染會(huì)抑制土壤脫氫酶活性.CYL處理組的脫氫酶活性多顯著高于CYH和CYH+CdH處理組(p＜0.05).這表明柴油量的增加以及柴油+鎘復(fù)合污染對(duì)脫氫酶活性的抑制作用更強(qiáng).CYH+CdH+P處理組的脫氫酶活性稍高于CYH和CYH+CdH處理組(見圖2).這說(shuō)明該作物在一定程度上能緩解柴油和鎘對(duì)脫氫酶的毒害,原因可能是由于番茄苗對(duì)柴油的吸附作用使氫受體的數(shù)量減少,從而使TTC的還原產(chǎn)物TPF的產(chǎn)量增加,即脫氫酶的活性增加[28-29].

鎘單獨(dú)污染對(duì)脫氫酶活性的影響有些復(fù)雜.在CdL處理組,實(shí)驗(yàn)初期(第8天)的脫氫酶活性反而增加,顯著高于CK及其他處理組(p＜0.05,見圖2);之后又下降,直至實(shí)驗(yàn)后期與其他處理組一樣,顯著低于CK組(p＜0.05,見圖2).與之不同,CdH處理組的脫氫酶活性接近CK組,至實(shí)驗(yàn)后期顯著低于CK組.這說(shuō)明鎘對(duì)土壤脫氫酶的毒害弱于柴油,且低濃度的鎘可能對(duì)脫氫酶還有激活效應(yīng).鎘對(duì)土壤脲酶和脫氫酶均有毒害[30-31].張平等[32]對(duì)衡陽(yáng)市鉛鋅礦區(qū)土壤酶活性的研究發(fā)現(xiàn),鎘對(duì)土壤脫氫酶的活性有抑制作用.湖南礦區(qū)水稻土受鎘污染影響,脫氫酶活性也有顯著降低[33].但也有研究認(rèn)為,隨著土壤鎘濃度的增加,對(duì)水稻根系脫氫酶活性的抑制并非持續(xù)增強(qiáng),有時(shí)反而會(huì)刺激酶的活性.比如,在紫色土污染實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)鎘質(zhì)量比為0.5 mg/kg時(shí),脫氫酶活性高于對(duì)照;而當(dāng)鎘質(zhì)量比增加至1 mg/kg時(shí),脫氫酶活性又低于對(duì)照;當(dāng)鎘質(zhì)量比繼續(xù)增加時(shí),脫氫酶活性先略有降低,之后反而持續(xù)增加;當(dāng)鎘質(zhì)量比增加至100 mg/kg時(shí),脫氫酶活性最大;當(dāng)鎘質(zhì)量比再繼續(xù)增加時(shí),脫氫酶活性又開始降低[34].因此,鎘對(duì)土壤脫氫酶活性的影響比較復(fù)雜,需作進(jìn)一步深入研究.

土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,是土壤物質(zhì)循環(huán)中最重要的組成部分,直接參與土壤中有機(jī)質(zhì)的分解和養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化過(guò)程,影響作物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[35].因此,微生物數(shù)量可以作為土壤健康和土壤質(zhì)量變化的重要指標(biāo)[36].本實(shí)驗(yàn)表明,高量柴油和高量柴油+鎘復(fù)合污染均會(huì)增加土壤細(xì)菌的數(shù)量,且后者達(dá)到顯著水平(p＜0.05);低量柴油處理能顯著增加真菌的活性(p＜0.05);柴油污染還能顯著增加放線菌的數(shù)量(p＜0.05,見圖3).但本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn),鎘單獨(dú)污染土壤時(shí)對(duì)土壤微生物種群和數(shù)量的影響不明顯(見圖3).總體上看,柴油污染會(huì)增加土壤中各類微生物的數(shù)量,與土壤脲酶活性增加的趨勢(shì)相關(guān)聯(lián),且實(shí)驗(yàn)各階段土壤微生物數(shù)量和脲酶活性有顯著相關(guān)性(r=0.585,p＜0.01).土壤油類污染反而會(huì)導(dǎo)致微生物數(shù)量增加的報(bào)道有很多.Tao等[37]的研究發(fā)現(xiàn),原油污染的土壤在室溫(20°C)培養(yǎng)30 d后,微生物生物多樣性指數(shù)有所增加,且土壤中碳?xì)浠衔锏娜コ蔬_(dá)34.7%.李慧等[38]在對(duì)沈陽(yáng)、撫順污灌區(qū)的石油污染狀況調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn),含油污水能夠刺激土壤微生物群落的生長(zhǎng).張晶等[39]的研究發(fā)現(xiàn),含油污水灌溉后,東北旱田土壤的微生物數(shù)量隨著石油烴含量的增加而增加.江偉等[40]的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)鎘質(zhì)量比為10 mg/kg時(shí),土壤微生物活性明顯增加.Baran等[41]指出,原油等多環(huán)芳烴類化合物進(jìn)入土壤后會(huì)刺激土壤微生物活性,微生物逐漸適應(yīng)并利用原油等多環(huán)芳烴類化合物作為碳源和能源.

4 結(jié)束語(yǔ)

盆栽實(shí)驗(yàn)表明,土壤脲酶和脫氫酶活性對(duì)土壤柴油、鎘和柴油+鎘復(fù)合污染有不同的反應(yīng).當(dāng)受到高量柴油污染或高量柴油+鎘復(fù)合污染時(shí),土壤脲酶活性反而顯著增加,微生物數(shù)量也有相應(yīng)增加.高量、低量柴油污染或高量柴油+鎘復(fù)合污染對(duì)土壤脫氫酶活性有抑制作用;但鎘單獨(dú)污染對(duì)土壤脫氫酶活性的影響較小,低質(zhì)量比鎘甚至對(duì)脫氫酶有一定激活效應(yīng).