王雅娟 曹新益 劉升明

結(jié)核病感染率高、死亡率高，但對(duì)其診斷不盡如人意[1]。在傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌病原診斷手段中，涂片鏡檢的敏感度低且無(wú)法區(qū)分其他抗酸桿菌，而培養(yǎng)周期長(zhǎng)，又不利于早期診斷。GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“Xpert”)是一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，因敏感度和特異度較高且周期短等優(yōu)點(diǎn)，已在2010年被世界衛(wèi)生組織推薦用于結(jié)核病快速診斷和利福平耐藥性篩查[2]，目前也在我國(guó)較廣泛地應(yīng)用。但2020年全球肺結(jié)核病原檢出率較2019年僅提高了2%，且各地區(qū)間檢出率差異較大[1]，因此，臨床仍需探索更快速有效的診斷方法。

隨著宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)的發(fā)展，其在臨床微生物檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，并顯示出良好的綜合應(yīng)用價(jià)值[3]。然而，目前比較mNGS與Xpert對(duì)結(jié)核病診斷價(jià)值的研究多以小樣本為主，且所得結(jié)果存在一定差異。因此，筆者對(duì)使用mNGS和Xpert診斷結(jié)核病準(zhǔn)確性的文獻(xiàn)進(jìn)行薈萃分析，比較兩種方法在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為優(yōu)化臨床快速診斷能力及加強(qiáng)治療和管理提供參考。

資料和方法

一、文獻(xiàn)來(lái)源及檢索策略

系統(tǒng)檢索PubMed、Embase、Cochrane Library、Web of Science、中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)、萬(wàn)方和維普數(shù)據(jù)庫(kù)自建庫(kù)至2022年7月5日公開(kāi)發(fā)表的關(guān)于mNGS與Xpert診斷結(jié)核病準(zhǔn)確性的文獻(xiàn)。檢索策略為“主題詞+自由詞”，中文檢索詞為：結(jié)核、結(jié)核分枝桿菌感染、分枝桿菌感染、宏基因組二代測(cè)序、高通量測(cè)序、二代測(cè)序、利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)等；英文檢索詞為：Tuberculosis、Mycobacteriumtuberculosisinfection、TB、Kochs disease、Metagenomic next-generation sequencing、Next-generation sequencing、mNGS、NGS、Xpert MTB/RIF、GeneXpert MTB/RIF、Xpert、GeneXpert等。以Embase數(shù)據(jù)庫(kù)為例的檢索策略見(jiàn)表1。

表1 以Embase數(shù)據(jù)庫(kù)為例的檢索策略

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)研究目的：比較mNGS和Xpert診斷結(jié)核病的準(zhǔn)確性；(2)研究對(duì)象：根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查等疑診為結(jié)核病患者；(3)檢測(cè)手段：同時(shí)予mNGS和Xpert檢測(cè)；(4)參考標(biāo)準(zhǔn)：培養(yǎng)或臨床綜合診斷結(jié)果；(5)結(jié)局指標(biāo)：有足夠建立診斷效能分析的四格表數(shù)據(jù)，即真陽(yáng)性(true positive，TP)值、假陽(yáng)性(false positive，F(xiàn)P)值、假陰性(false negative，F(xiàn)N)值、真陰性(true negative，TN)值。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)文獻(xiàn)類型為病例報(bào)告、綜述、 會(huì)議論文、評(píng)論、摘要、信件、專家意見(jiàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；(2)重復(fù)文獻(xiàn)；(3)無(wú)法獲取全文文獻(xiàn)。

二、研究方法

1.文獻(xiàn)篩選及數(shù)據(jù)提取：由2名研究者根據(jù)納排標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立篩選和納入文獻(xiàn)，以預(yù)先制定的資料表提取數(shù)據(jù)，若結(jié)果有分歧則通過(guò)小組協(xié)商解決。提取的資料包括第一作者、發(fā)表年份、研究設(shè)計(jì)、地區(qū)、樣本來(lái)源、樣本量、樣本年齡和性別組成、標(biāo)本類型、檢測(cè)方法、參考標(biāo)準(zhǔn)、TP值、FP值、FN值和TN值等。

2.偏倚風(fēng)險(xiǎn)和適用性評(píng)價(jià)：使用診斷準(zhǔn)確性試驗(yàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)工具(quality assessment of diagnostic accuracy studies-2，QUADAS-2)[4]對(duì)所有最終納入文獻(xiàn)分別從偏倚風(fēng)險(xiǎn)和適用性兩方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括病例選擇、待評(píng)價(jià)試驗(yàn)、參考標(biāo)準(zhǔn)、流程與進(jìn)展4個(gè)部分。滿足評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為“是”，不滿足評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為“否”，部分滿足或描述不詳細(xì)為“不清楚”。每個(gè)部分中所有問(wèn)題均回答為“是”時(shí)即為“低風(fēng)險(xiǎn)(low risk)”，其中任一問(wèn)題回答為“否”即為“高風(fēng)險(xiǎn)(high risk)”，其他情況為“不清楚風(fēng)險(xiǎn)(unclear risk)”。評(píng)價(jià)過(guò)程由2名研究者獨(dú)立完成，必要時(shí)小組協(xié)商決定。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用R 4.2.0和R Studio 2022.07.0+548軟件、meta 5.5-0和mada 0.5.11軟件包及其依賴包進(jìn)行資料的統(tǒng)計(jì)分析。

1.診斷準(zhǔn)確性試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)：根據(jù)四格表數(shù)據(jù)分別計(jì)算每個(gè)納入研究待評(píng)價(jià)試驗(yàn)的敏感度、特異度、診斷比值比及其95%可信區(qū)間(95%CI)；采用mada軟件包雙變量模型擬合綜合受試者工作特征曲線(SROC曲線)，并計(jì)算其曲線下面積(AUC)。

2.異質(zhì)性分析：(1)閾值效應(yīng)檢驗(yàn)：計(jì)算敏感度與(1-特異度)對(duì)數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)r，若相關(guān)系數(shù)r>0.6、P<0.05或SROC曲線呈典型“肩臂狀”分布，即提示存在閾值效應(yīng)，此時(shí)通過(guò) AUC值評(píng)價(jià)診斷效能，否則進(jìn)一步合并效應(yīng)量；(2)非閾值效應(yīng)檢驗(yàn)：通過(guò)I2統(tǒng)計(jì)量和Cochrane-Q檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，若I2>50%(代表中度以上的異質(zhì)性)、P<0.05，則采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量以部分消除異質(zhì)性對(duì)結(jié)果的影響，否則采用固定效應(yīng)模型。根據(jù)不同的標(biāo)本進(jìn)行亞組分析。

3.發(fā)表偏倚分析：采用Deeks漏斗圖檢驗(yàn)發(fā)表偏倚，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

4.敏感性分析：分別以敏感度、特異度和診斷比值比作為敏感性分析指標(biāo)，采用逐一剔除文獻(xiàn)法，以評(píng)價(jià)本研究所得結(jié)果的穩(wěn)定性。

結(jié) 果

一、文獻(xiàn)檢索結(jié)果及納入研究的基本特征

共檢索到666篇文獻(xiàn)，根據(jù)納排標(biāo)準(zhǔn)，最終納入12篇文獻(xiàn)[5-16]，包括中文文獻(xiàn)5篇(即文獻(xiàn)5～7、11和 15)、英文文獻(xiàn)7篇(即文獻(xiàn)8～10、12～14和16)；其中，文獻(xiàn)5、14和15無(wú)mNGS和Xpert并聯(lián)診斷的完整四格表資料。共納入1344例患者，其中，檢測(cè)肺組織標(biāo)本(不包括胸腔積液和淋巴結(jié))685例、肺外組織標(biāo)本659例；最終871例診斷為結(jié)核病，包括肺結(jié)核412例和肺外結(jié)核459例。文獻(xiàn)篩選流程見(jiàn)圖1，納入研究文獻(xiàn)基本信息及數(shù)據(jù)資料見(jiàn)表2、3。

表2 納入研究文獻(xiàn)的基本信息

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

二、偏倚風(fēng)險(xiǎn)和適用性分析結(jié)果

QUADAS-2量表評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，12篇文獻(xiàn)均未提及詳細(xì)的盲法設(shè)計(jì)方案?！安±x擇”部分，文獻(xiàn)11采用病例-對(duì)照設(shè)計(jì)被判斷為“高風(fēng)險(xiǎn)”；“參考標(biāo)準(zhǔn)”部分，文獻(xiàn)8、10和14的參考標(biāo)準(zhǔn)包含mNGS或Xpert檢測(cè)陽(yáng)性，文獻(xiàn)13包含Xpert檢測(cè)陽(yáng)性，故均被判斷為“高風(fēng)險(xiǎn)”，其余各部分文獻(xiàn)評(píng)價(jià)均無(wú)“高風(fēng)險(xiǎn)”，具體見(jiàn)表4。

表3 納入研究文獻(xiàn)的原始數(shù)據(jù)資料 (例)

表4 納入研究的QUADAS-2量表風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果

三、Meta分析結(jié)果

1.診斷準(zhǔn)確性試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)：根據(jù)表3數(shù)據(jù)分別計(jì)算各納入研究中mNGS、Xpert和mNGS+Xpert檢測(cè)方法的敏感度、特異度、診斷比值比及其95%CI，具體見(jiàn)表5。再繪制3種檢測(cè)方法的SROC曲線，獲得AUC值分別為0.931、0.860和0.978(圖2)。

表5 納入研究的診斷準(zhǔn)確性試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)

續(xù)表5

圖2 三種檢測(cè)方法診斷結(jié)核病的綜合受試者工作特征曲線

2.異質(zhì)性檢驗(yàn)：(1)閾值效應(yīng)檢驗(yàn)：mNGS、Xpert和mNGS+Xpert 檢測(cè)方法的Spearman相關(guān)系數(shù)r分別為：-0.119(P=0.712)、0.403(P=0.194)和-0.527(P=0.145)，均不存在明顯閾值效應(yīng)。(2)非閾值效應(yīng)檢驗(yàn)：mNGS檢測(cè)的敏感度、特異度、診斷比值比的I2統(tǒng)計(jì)量和Cochrane-Q檢驗(yàn)結(jié)果分別為I2=92.3%和P<0.01、I2=0.0%和P=0.896、I2=0.0%和P=0.716；Xpert的結(jié)果分別為I2=90.0%和P<0.01、I2=0.0%和P=0.732、I2=36.5%和P=0.098；mNGS+Xpert的結(jié)果分別為I2=92.3%和P<0.01、I2=0.0%和P=0.951、I2=0.0%和P=0.436。各研究間mNGS、Xpert及mNGS+Xpert并聯(lián)診斷的敏感度異質(zhì)性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量；特異度和診斷比值比的異質(zhì)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并。

3.合并分析結(jié)果：mNGS診斷結(jié)核病的合并敏感度、合并特異度、合并診斷比值比及其95%CI分別為：63.4%(54.4%～73.8%)、99.8%(98.9%～100.0%)和58.6(29.6～115.8)，Xpert分別為50.3%(41.2%～61.3%)、99.9%(99.1%～100.0%)和23.8(12.3～46.0)，mNGS+Xpert分別為68.7%(60.1%～78.6%)、99.8%(98.9%～100.0%)和91.2(40.2～207.3)(圖3～5)。進(jìn)一步根據(jù)標(biāo)本類型，將納入研究分為肺泡灌洗液組、腦脊液組、其他肺外(不包含腦脊液)或多部位標(biāo)本組，分析mNGS、Xpert及兩者并聯(lián)診斷在各組中的合并敏感度及特異度(表6)。

表6 mNGS、Xpert及兩者并聯(lián)診斷在不同類型標(biāo)本中的合并診斷效能

圖3 mNGS診斷結(jié)核病的敏感度、特異度和診斷比值比森林圖

圖4 Xpert診斷結(jié)核病的敏感度、特異度和診斷比值比森林圖

圖5 mNGS+Xpert診斷結(jié)核病的敏感度、特異度和診斷比值比森林圖

4.發(fā)表偏倚：采用Deeks漏斗圖進(jìn)行發(fā)表偏倚檢驗(yàn)(圖6)，結(jié)果顯示：mNGS、Xpert和mNGS+Xpert三種檢測(cè)方法均存在發(fā)表偏倚(P=0.013、0.010、0.033)。

圖6 mNGS、Xpert和mNGS+Xpert三種檢測(cè)方法的發(fā)表偏倚Deeks漏斗圖分析

5.敏感性分析：分別對(duì)合并敏感度、特異度、診斷比值比進(jìn)行敏感性分析，逐一剔除各項(xiàng)研究，結(jié)果顯示，所得合并統(tǒng)計(jì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，研究所得結(jié)果較為穩(wěn)定。具體見(jiàn)圖7～9。

圖7 mNGS的敏感性分析結(jié)果

圖8 Xpert的敏感性分析結(jié)果

圖9 mNGS+Xpert的敏感性分析結(jié)果

討 論

全球結(jié)核病防治是一場(chǎng)持久戰(zhàn)，早期診斷在其中具有舉足輕重的地位。當(dāng)前的許多研究均表明了mNGS和Xpert相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)，但受限于mNGS和Xpert較高的檢測(cè)成本，臨床上較少將其聯(lián)合應(yīng)用于臨床一線診斷。因此，有必要比較兩者診斷結(jié)核病的效能，以供臨床選擇和參考，但目前尚缺少比較兩者對(duì)結(jié)核病診斷準(zhǔn)確性試驗(yàn)的Meta 分析。

本文對(duì)納入的12項(xiàng)研究進(jìn)行了薈萃分析，以綜合比較mNGS和Xpert診斷結(jié)核病的準(zhǔn)確性。綜合分析顯示，mNGS和Xpert均具有良好的結(jié)核病診斷能力，其中，前者合并敏感度、合并診斷比值比及AUC值均較Xpert高；而且，將二者聯(lián)合后的診斷效能更高，明顯提高了合并敏感度和診斷比值比，AUC值達(dá)到了0.978。此外，兩種檢測(cè)方法及其聯(lián)合檢測(cè)的合并特異度均>95%，差異不大，提示誤診率均較低。

既往研究表明，標(biāo)本類型可影響mNGS和Xpert診斷結(jié)核病的敏感度和特異度[17-20]，這可能是本次Meta分析納入的研究在敏感度方面異質(zhì)性較大的原因。本研究根據(jù)標(biāo)本類型進(jìn)一步將納入的研究分為3組，Meta分析得出：Xpert檢測(cè)肺泡灌洗液的敏感度最高(63.8%)，與mNGS檢測(cè)的敏感度相差不大(64.3%)，而在腦脊液中的檢出最低(41.8%)；mNGS在腦脊液組和其他肺外或多部位標(biāo)本組中的檢測(cè)敏感度(64.6%和60.8%)均優(yōu)于Xpert(41.8%和50.8%)，但兩者檢測(cè)不同標(biāo)本類型的特異度無(wú)明顯差異，且均>95%。另外，本文納入的文獻(xiàn)參考標(biāo)準(zhǔn)不完全一致，其中有2篇參考標(biāo)準(zhǔn)為臨床診斷，1篇為液體培養(yǎng)，其他均為病原學(xué)加臨床復(fù)合診斷，這也可能造成研究結(jié)果的異質(zhì)性。通過(guò)進(jìn)一步行敏感性分析表明，剔除任一篇文獻(xiàn)后所得的合并敏感度、特異度、診斷比值比均無(wú)明顯變化，可認(rèn)為所得結(jié)果較為可靠。

本研究尚存在以下不足：首先，納入的12項(xiàng)研究中，研究地區(qū)均為中國(guó)，患者年齡均>18歲，缺少結(jié)核病低負(fù)擔(dān)地區(qū)及兒童結(jié)核病相關(guān)的研究，不同發(fā)病率地區(qū)和兒童檢測(cè)標(biāo)本可能會(huì)影響mNGS和Xpert的診斷效能[17, 21-22]。其次，雖然本研究進(jìn)一步對(duì)標(biāo)本類型進(jìn)行了分組分析，但并未發(fā)現(xiàn)造成異質(zhì)性的具體來(lái)源。此外，Deeks檢驗(yàn)提示不排除存在發(fā)表偏倚，可能會(huì)造成所得診斷效能的高估，今后需納入更多新的研究進(jìn)行分析。最后，雖然mNGS在診斷感染性疾病中有諸多優(yōu)勢(shì)，但要注意的是，在臨床應(yīng)用前，往往還需要區(qū)分定植菌、污染菌以及對(duì)報(bào)告進(jìn)行準(zhǔn)確解讀[23]。

綜上所述，mNGS和Xpert對(duì)結(jié)核病診斷均具有應(yīng)用價(jià)值，且Xpert聯(lián)合mNGS檢測(cè)和mNGS單一檢測(cè)的總體敏感度均高于Xpert，而特異度相差不大。鑒于檢測(cè)成本等問(wèn)題，筆者建議mNGS檢測(cè)可應(yīng)用于危重癥、混合感染等復(fù)雜病例；而對(duì)Xpert檢測(cè)陰性但臨床仍懷疑結(jié)核分枝桿菌感染的病例，尤其是肺外結(jié)核，Xpert聯(lián)合mNGS檢測(cè)也有望提高病原檢出率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)王雅娟：直接參與研究方案設(shè)計(jì)、實(shí)施研究和撰寫文章；曹新益：參與采集數(shù)據(jù)、分析和解釋數(shù)據(jù)；劉升明：直接參與研究方案設(shè)計(jì)、指導(dǎo)研究實(shí)施和審閱文章