王珍，梁麗娜，馬群英，秦虹，唐由之

單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是一組人類常見的病原體，每年在全世界引起數(shù)百萬例感染[1]，其有2 種形式：原發(fā)性感染和復(fù)發(fā)性感染。原發(fā)感染后，HSV 在上皮細胞中有效復(fù)制，并通過神經(jīng)末端進入感覺神經(jīng)元。逆行轉(zhuǎn)運后，病毒基因組被遞送到細胞核中，并建立了終生潛伏的感染[2]。在適宜的刺激下，如紫外線照射、發(fā)熱、疲勞、外傷、精神壓力，月經(jīng)以及一些免疫缺陷病[3]，可使單皰病毒活化增殖，形成復(fù)發(fā)性單皰病毒性角膜炎（herpes simple keratitis，HSK）。復(fù)發(fā)性HSK 的危害遠遠高于角膜感染本身，復(fù)發(fā)性HSK 的無限制的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致無法挽回的組織學(xué)損害，包括角膜新生血管形成、角膜斑翳、乃至失明[4]。目前，尚無治療復(fù)發(fā)性HSK 的特效藥物，探索干預(yù)復(fù)發(fā)性HSK 的有效藥物仍是研究的熱點和難點。中藥復(fù)方雙秦眼用凝膠是醫(yī)院制劑，本課題前期研究證實，雙秦眼用凝膠有抗炎、抗病毒、減少HSK 復(fù)發(fā)等功效，本實驗觀察雙秦眼用凝膠對復(fù)發(fā)性HSK 小鼠的干預(yù)作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用SPF 級BALB/c 小白鼠48 只，雌性，5～8 周齡，體質(zhì)量20～25 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[許可證號：SCXK（京）2012-0001）]。無菌環(huán)境下飼養(yǎng)，22～25℃，循環(huán)光照(8 h/16 h,光照/黑暗)。實驗前雙眼前節(jié)和眼底檢查均正常。實驗動物及實驗條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

1.2 主要藥品、試劑及儀器

凝膠基質(zhì)、雙秦眼用凝膠（中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所加工制備），無環(huán)鳥苷（aciclovir，ACV）滴眼液（8 mL∶8 mg，武漢五景藥業(yè)有限公司，13020102），氯霉素滴眼液（武漢天天明藥業(yè)有限責(zé)任公司，121201-064），鹽酸奧布卡因滴眼液（倍諾喜）（日本參天制藥株式會社，B1018），熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，120602），氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)有限公司，110530），鹽酸賽拉嗪注射液（陸眠寧）（吉林華牧動物保健品，201010），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒、白細胞介素-17（interleukin 17,IL17）免疫組織化學(xué)試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司），病毒液為HSV-I SM44 株（中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院實驗室），非洲綠猴腎細胞[African green monkey kidney cells(Verda reno)，VERO]（北京協(xié)和細胞資源中心），裂隙燈顯微鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司，Y Z-5T），PCR 電泳儀（北京市六一儀器廠，DY Y-6C）。

1.3 分組及干預(yù)方法

將48 只小鼠按隨機數(shù)字表法分為4 組：凝膠基質(zhì)組（A 組）、雙秦眼用凝膠組（B 組）、無環(huán)鳥苷滴眼液組（C 組）、無環(huán)鳥苷+可的松滴眼液組（D 組），每組各12 只。待造模成功后第2 d 開始治療，A 組為對照組，予凝膠基質(zhì)點眼，每日4 次；B 組予雙秦眼用凝膠點眼，每日4 次；C 組予無環(huán)鳥苷滴眼液點眼，每日6 次；D 組予無環(huán)鳥苷滴眼液+可的松（0.5 mg/0.1 mL）點眼，每日6次。各組均治療14 d。

1.4 復(fù)發(fā)性HSK模型建立

1.4.1 初次發(fā)病模型建立 HSK 造模的造模法[5]：將A、B、C、D 4 組小鼠術(shù)前12 h 禁食水。麻醉劑按氯胺酮40 mg/kg體重、陸眠寧5 mg/kg體重標準配制成水溶液，右后肢肌肉麻醉，右眼點用氯霉素滴眼液，向小鼠腹腔注射人的抗HSV-1 血清1 mL，間隔5 min 后，右眼滴鹽酸奧布卡因滴眼液，用25 號無菌手術(shù)刀片輕柔刮除右眼角膜上皮，滴入HSV-1 型SM44株病毒原液（5 μL），病毒滴度為1×107pfu/mL，閉眼輕柔按摩小鼠眼瞼30 s。

1.4.2 原發(fā)HSK 的檢測方法及判定標準 HSK 的檢測方法[5]：將VERO細胞用24板孔培養(yǎng)。VERO細胞呈棱形貼壁生長，當(dāng)VERO 細胞呈單層且相互融合時待用。在HSV-1 角膜接種后的7 d，每日用蘸有MEM的濕棉片擦拭左眼角膜表面的淚液膜，然后將其放入盛有1 mL MEM 的試管中吹打6 次，取0.2 mL 角膜擦拭液移入上述VERO 細胞培養(yǎng)板的1 個孔中，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每天在相差倒置的顯微鏡下觀察VERO細胞是否出現(xiàn)細胞球形變、漂浮、集攏等細胞病理學(xué)改變（cell pathological effects，CPE），CPE 陽性者表明該角膜擦拭液中有病毒復(fù)制（圖1A），在HSV-1角膜接種后的14 d內(nèi)，每天用裂隙燈顯微鏡檢查角膜病變，凡是角膜呈現(xiàn)點狀、樹枝狀（圖1B）、地圖狀角膜炎且角膜擦拭液中有病毒復(fù)制的鼠被判定為患HSK。

1.4.3 復(fù)發(fā)模型的建立將上述感染HSK 的小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)6 周，以便其急性上皮型角膜炎愈合并使病毒在三叉神經(jīng)節(jié)或角膜內(nèi)建立潛伏感染。飼養(yǎng)期間，每周用裂隙燈顯微鏡檢查角膜1次，觀察HSK有無自發(fā)性復(fù)發(fā)。6 周后將處于病毒潛伏期且角膜恢復(fù)光滑透明的小鼠用紫外線（波長302 nm，強度170 mJ/cm2）照射右眼。

1.4.4 復(fù)發(fā)HSK 的檢測方法及判定標準紫外線照射后的當(dāng)天及隨后7 d，每日用蘸有MEM 的濕棉片擦拭右眼角膜表面的淚液膜，并通過VERO 細胞培養(yǎng)檢測有無CPE 改變，CPE 陽性則表明該角膜擦拭液中有病毒復(fù)制，即判定HSK 復(fù)發(fā)[5-6]，提示復(fù)發(fā)性HSK 模型建立成功。感染眼于造模后第1、3、5、7、10、12、14 d，行裂隙燈檢查，觀察病變情況，癥狀評分標準參考夏麗坤等[5]的文獻制定（表1）。

表1 病變評分標準

1.5 組織病理學(xué)

治療干預(yù)14 d 后斷頸處死所有小鼠，在無菌條件下，將彎鑷從外眥部垂直探入，至眼球下方夾住視神經(jīng)，平行向上提起，摘出眼球，將眼球置于4%多聚甲醛內(nèi)留作石蠟包埋、HE 染色、免疫組織化學(xué)，同時取小鼠右眼外周血，4℃，3,000 rpm，離心15 min，取上清，凍存于-20℃，留作ELISA。

把小鼠眼球組織放入15 mL 管里，加入新鮮4%多聚甲醛，或配好新鮮4%多聚甲醛1.5 mL 存放于4°C，組織放進去最長48 h 室溫。倒掉固定液，梯度酒精脫水，角膜朝下放入包埋盒中，視神經(jīng)方向與包埋盒垂直，石蠟包埋，每個眼球組織間斷切片3 張，厚度5 μm，HE 染色，光鏡檢查，顯微彩色數(shù)碼相機照相。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測IL-17抗體

石蠟切片脫蠟水化，56℃加熱切片15 min融蠟，然后梯度脫水后，抗原修復(fù)，將切片浸在3%H2O2甲醇溶液（新鮮配置）中，滴加一抗（0.25% Triton 稀釋），滴加二抗（溶液B）、鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液（溶液C）、DAB 溶液，脫水透明，中性樹膠封固。

1.7 ELISA檢測TNF-α

用藥后14 d 處死全部小鼠，摘小鼠右眼球，取外周血500 μL，血標本4℃3,000 rpm離心15 min,留上清備用，行ELISA方法檢測：分別在標準品孔和樣品孔中加入標準品和樣品稀釋液，然后加入檢測抗體，孵育、洗滌5次，加底物、孵育、加終止液,在酶標儀450 nm波長處測定各孔OD值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS26.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用完全隨機設(shè)計單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗。當(dāng)P＜0.05 時，認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為學(xué)改變

病毒接種后部分小鼠蜷縮，少動，進食少，大部分活潑，生長良好。由于造模麻醉原因總死亡4 只（其中A組1 只，B組1 只，C組0只，D組2 只）。

2.2 紫外線光照射后小鼠角膜、結(jié)膜改變

2.2.1 角膜病變變化情況紫外線照射小鼠后第1 d，由于角膜受到光損傷的影響，4 組小鼠的角膜病變評分均達到峰值，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；從第3 d開始，B組評分均低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t3d=2.273，P=0.029；t5d=5.874，P=0.000；t7d=-2.459，P=0.020；t10d=2.142，P=0.039；t12d=8.607，P=0.000；t14d=6.576，P=0.000）。第5 d、12 d、14 d，B 組評分均低于C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t5d=4.854，P=0.000；t12d=4.510，P=0.000；t14d=2.090，P=0.035）。第5 d，B 組評分低于D 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.265，P=0.003）（表2，圖3、圖4）。

表2 紫外線照射后不同時間點小鼠角膜病變評分（，分）

表2 紫外線照射后不同時間點小鼠角膜病變評分（，分）

注：*與A 組比較，P＜0.05；#與C 組比較，P＜0.05；&與D 組比較，P＜0.05；A 組凝膠基質(zhì)組；B 組雙秦眼用凝膠組；C 組無環(huán)鳥苷滴眼液組；D組無環(huán)鳥苷+可的松滴眼液組

2.2.2 結(jié)膜病變變化情況紫外線照射小鼠后第1 d，4組小鼠的結(jié)膜病變評分均達到峰值，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。隨著治療的進行，各組小鼠的角膜病變評分均處于逐漸下降的趨勢；從第3 d開始，B 組評分均低于A 組，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t3d=5.620，P=0.000；t5d=3.299，P=0.002；t7d=8.426，P=0.000；t10d=12.515，P=0.000；t12d=8.318，P=0.000；t14d=16.353，P=0.000)。且從第10 d開始，B組評分均低于C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t10d=2.657，P=0.012；t12d=4.102，t14d=6.869，均P=0.000)（表3，圖5）。

表3 紫外線照射后不同時間點小鼠結(jié)膜病變評分（，分）

表3 紫外線照射后不同時間點小鼠結(jié)膜病變評分（，分）

注：*與A 組比較，P＜0.05；#與C 組比較，P＜0.05；A 組凝膠基質(zhì)組；B 組雙秦眼用凝膠組；C 組無環(huán)鳥苷滴眼液組；D 組無環(huán)鳥苷+可的松滴眼液組

2.3 角膜組織病理學(xué)變化

治療14 d 后處死小鼠，制作角膜組織病理切片，HE 染色觀察各組角膜結(jié)構(gòu)（圖3）。A 組角膜基質(zhì)層纖維變性、水腫，且有炎性細胞；B 組基質(zhì)層輕度水腫，各層結(jié)構(gòu)大致正常；C組角膜基質(zhì)層有大量炎性細胞；D 組基質(zhì)層纖維變性明顯、伴有高度水腫，上皮層結(jié)構(gòu)不完整。

2.4 角膜IL-17抗體陽性細胞的表達

各組角膜內(nèi)IL-17 抗體陽性細胞的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.334，P=0.000），與A 組比較，其余3 組的IL-17 的表達量均較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tB組=6.379，P=0.000；tC組=2.490，P=0.020；tD組=9.478，P=0.000），并且B 組表達量低于C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.889，P=0.001）（表4，圖4）。

2.5 角膜TNF-α的含量變化

各組角膜內(nèi)TNF-α 的含量差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.986，P=0.013），與A 組比較，B 組、C 組角膜內(nèi)TNF-α 的含量均較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（tB組=2.652,P=0.016；tC組=2.979,P=0.008）（表4）。

表4 4組小鼠角膜內(nèi)IL-17和TNF-α表達的比較（）

表4 4組小鼠角膜內(nèi)IL-17和TNF-α表達的比較（）

注：a IL-17 檢測各組n=7；b TNF-α 檢測各組n=4；*與A 組比較，P＜0.05；#與C組比較，P＜0.05；A組凝膠基質(zhì)組；B組雙秦眼用凝膠組；C組無環(huán)鳥苷滴眼液組；D組無環(huán)鳥苷+可的松滴眼液組

3 討論

HSV 具有兩種血清型HSV-1 和HSV-2[7]，HSV-1感染眼角膜組織引起HSK，是臨床最常見的引起角膜潰瘍的原因[8]，是導(dǎo)致視力喪失甚至失明的主要疾病之一[9]，其致盲率在角膜病中占第1 位[10]。機體在初次感染皰疹病毒后在三叉神經(jīng)節(jié)形成潛伏感染，在一定的刺激條件下誘導(dǎo)其復(fù)發(fā)，以致反復(fù)發(fā)作、遷延不愈[11]。目前公認HSK 是一種由單純皰疹病毒及病毒抗原引起的T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫病理性疾病。IL-17 主要由CD4+T 細胞Th17 細胞分泌，可以促進T 細胞的激活和刺激成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、上皮細胞產(chǎn)生多種致炎因素(包括IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、粒細胞集落刺激因子、前列腺素E2、金屬蛋白酶等)，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生［12-13］。張勝男等[14]發(fā)現(xiàn)IL-17 在復(fù)發(fā)性HSK 小鼠模型的角膜成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、基質(zhì)層中的炎癥細胞均有表達。IL-17 在外周血中CD4+T 細胞中的表達與疾病嚴重程度呈正相關(guān)。TNF-α 是急性炎癥期間巨噬細胞/單核細胞產(chǎn)生的炎癥細胞因子，負責(zé)細胞內(nèi)的各種信號傳導(dǎo)事件，導(dǎo)致壞死或凋亡[15]，是目前與炎癥損傷關(guān)系最密切的因子之一[16]。TNF-α作為促炎性因子，介導(dǎo)炎癥的級聯(lián)式反應(yīng)，通過與

其他炎性因子的相互作用將炎性反應(yīng)放大，反映繼發(fā)性炎癥損傷狀態(tài)[17]。

中醫(yī)學(xué)認為，HSK 發(fā)于黑睛，在五輪學(xué)說中病屬風(fēng)輪，在臟屬肝。本病多為風(fēng)熱之邪誘發(fā)，起初毒邪尚淺，黑睛出現(xiàn)星點狀翳稱“銀星獨現(xiàn)”。如風(fēng)熱之邪更進一步則生簇狀片狀樹枝狀云翳，稱聚星障，隨著外邪的進一步熾盛，向內(nèi)深入，易產(chǎn)生花翳白陷，凝脂翳、混睛障等重癥[18]。中藥復(fù)方雙秦眼用凝膠由秦皮、秦艽等組成，秦皮味苦、澀、性寒，歸肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、收澀明目之功效，中醫(yī)眼科常用秦皮治療目腫赤痛、目生翳膜；秦艽味苦、辛、性平，歸肝、膽、胃經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛之功效。二者合用，共奏清熱祛風(fēng)、退翳明目之功。另外，眼用凝膠眼表滯留時間長，可增加藥物在眼部的吸收，使藥物緩慢由結(jié)膜傳遞至鼻腔，減少因全身吸收引起的毒副作用[19]。

本研究結(jié)果顯示，3 個治療組對小鼠的角膜、結(jié)膜病變均有一定的治療作用，其中雙秦眼用凝膠組對復(fù)發(fā)性HSK 小鼠的角膜保護作用發(fā)揮最早，并與無環(huán)鳥苷+可的松組對結(jié)膜病變的抑制作用較為顯著；對復(fù)發(fā)性HSK 小鼠的角膜的保護作用較其余各組更加明顯，其角膜基質(zhì)層僅有輕度水腫，且各層結(jié)構(gòu)大致正常；3個治療組對角膜內(nèi)IL-17的表達均有抑制作用，其中尤以雙秦眼用凝膠組和無環(huán)鳥苷+可的松滴眼液組的抑制作用最為明顯；雙秦眼用凝膠和無環(huán)鳥苷均對角膜內(nèi)的TNF-α 的含量有抑制作用，可抑制TNF-α誘導(dǎo)的細胞凋亡。

本課題前期研究[6,20]發(fā)現(xiàn)雙秦眼用凝膠對HSK有良好的治療及抗復(fù)發(fā)作用，通過本次研究可以得知，雙秦眼用凝膠對于復(fù)發(fā)性HSK 同樣具有一定的治療作用。復(fù)發(fā)性HSK 的成功治療可縮短疾病持續(xù)時間，防止導(dǎo)致視力喪失的進行性角膜瘢痕形成，并降低進一步復(fù)發(fā)的風(fēng)險[21]。本研究為復(fù)發(fā)性HSK 的治療提供了新的方法和思路。但是由于樣本量較少，本次實驗尚有不足之處，故雙秦眼用凝膠對實驗性小鼠復(fù)發(fā)性HSK 的干預(yù)作用及機制仍需在增加樣本量的基礎(chǔ)上進一步研究、探討。