方越，劉新泉，蘇晶

年齡相關(guān)性黃斑變性（age related macular degeneration，AMD）是老年人群中視力進行性或不可逆性喪失的主要原因[1]，發(fā)病率逐年上升[2]，嚴重影響患者生活質(zhì)量。AMD 有2 種形式，其中干性年齡相關(guān)性黃斑變性（dry AMD，dAMD）最常見，約占AMD 總數(shù)的80%。尋找安全有效的治療藥物成為dAMD 研究亟待解決的問題[3]。在各種因素導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的作用下，視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）細胞發(fā)生凋亡[4]，是dAMD進展的關(guān)鍵因素之一。中醫(yī)學(xué)在治療AMD 方面進行了長期廣泛的臨床實踐，但是缺乏現(xiàn)代科學(xué)的理論依據(jù)。滋陰補腎片（Ziyin BushenTablet，ZYBS）是源于范氏眼科祖?zhèn)髋浞?，也是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院的院內(nèi)制劑，至今已使用40余年。前期臨床觀察[5-6]發(fā)現(xiàn)，ZYBS 對dAMD 患者有一定療效，但其藥理作用機制尚不明確。基于此，本實驗將通過碘酸鈉（NaIO3）誘導(dǎo)的大鼠dAMD 模型，探討ZYBS 對視網(wǎng)膜氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級5～6 周齡雄性SD 大鼠60 只，體重180～200 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司公司，實驗動物合格證號[SCXK（滬）2019-0005]。飼養(yǎng)溫度維持在20℃～25℃，晝夜節(jié)律，自由飲食飲水。本實驗由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準（倫理審批號：PZSHUTCM22080822）。

1.2 藥品、試劑與儀器

ZYBS（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院），維生素E 軟膠囊（上海信誼延安藥業(yè)有限公司，03200701），活性氧（reactive oxygen species，ROS）、脂質(zhì)氧化（superoxide dismutase，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（碧云天生物科技股份有限公司，S0033s、S0131S、S0073、S0101s），TUNEL 細胞原位凋亡試劑盒（瑞士Roche公司，12156792910），蘇木素伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒（碧云天生物科技股份有限公司，C0105s），4%多聚甲醛（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，P1110）。光學(xué)顯微鏡、冰凍切片機（德國Leica公司，DM2500、CMl850）。

1.3 建立dAMD大鼠模型

根據(jù)文獻[7-8]和前期預(yù)實驗結(jié)果，采用40 mg/kg的NaIO3鼠尾靜脈注射建立dAMD 大鼠模型。注射7 d 后即可在視網(wǎng)膜組織學(xué)切片檢查中見視網(wǎng)膜RPE、感光細胞和內(nèi)層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變薄、排列混亂等改變，提示造模成功。

1.4 分組與給藥

將造模成功的50 只大鼠隨機分為模型組（model group，MG）、陽性對照藥維生素E 組（vitamin E group，VE）、低劑量ZYBS 組（LZYBS）、中劑量ZYBS 組（MZYBS）、高劑量ZYBS 組（HZYBS），另將尾靜脈注射生理鹽水的大鼠設(shè)為對照組（control group，CG），每組10 只。根據(jù)60 kg 成人體重與大鼠的等效劑量計算，維生素E 灌胃劑量為0.20 g/kg，LZYBS、MZYBS、HZYBS分別灌胃0.23、0.47、0.94 g/kg的ZYBS，CG、MG 組灌胃等體積蒸餾水，每日1 次，連續(xù)灌胃3周。

1.5 HE染色檢測大鼠視網(wǎng)膜病理形態(tài)

引頸處死大鼠后快速摘除大鼠眼球，固定后沿角鞏膜緣剪開，取視杯組織再次固定，分級脫水后石蠟包埋，沿眼軸方做連續(xù)4 μm切片，然后進行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的變化，每組隨機選取3 張切片，每張切片于200 倍放大倍數(shù)下選擇5個不重疊的視野區(qū)域（以視神經(jīng)為中心，兩側(cè)各選擇2～3 個視野）并拍片。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件。

1.6 TUNEL凋亡檢測細胞凋亡

取材后制作視網(wǎng)膜石蠟包埋切片，按照TUNEL試劑盒說明進行相關(guān)檢測后，熒光顯微鏡下觀察，自視盤向鋸齒緣方向連續(xù)取3 個視野，記錄每個視野中染色陽性細胞數(shù)及感光細胞總數(shù)，抽樣6 張不同切片，計算平均感光細胞凋亡率。細胞計數(shù)采用3Y-Pixel-PRO 分析軟件，感光細胞凋亡率（%）=陽性細胞數(shù)／感光細胞總數(shù)×100%。

1.7 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

制備大鼠血清，按照試劑盒說明書檢測大鼠血清ROS、MDA、SOD、GSH-Px 表達水平，在酶標(biāo)儀405 nm處測定各孔吸光度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料，方差分析（ANOVA）進行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗，當(dāng)P＜0.05時，認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZYBS對dAMD大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)的影響

CG 組大鼠視網(wǎng)膜層次清晰，細胞排列整齊，外核層（outer nuclear layer，ONL）、內(nèi)核層（inter nuclear layer，INL）細胞間連接緊密，與Bruch膜貼附良好。MG 組可見視網(wǎng)膜變薄，視網(wǎng)膜全層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯損傷，各層細胞排列紊亂，并出現(xiàn)波浪樣改變，感光細胞層出現(xiàn)大量空泡，細胞外節(jié)段視不清，ONL、INL 細胞減少，與Bruch 膜間有空隙。相比CG組，MG、LZYBS、HZYBS 組大鼠視網(wǎng)膜仍見波浪樣改變，MG、LZYBS 組視網(wǎng)膜各層細胞稀疏，排列紊亂，MG 組更為明顯。而MZYBS、VE 組大鼠視網(wǎng)膜未見明顯波浪樣改變，ONL細胞可維持在大約7～8層，且細胞排列相對整齊（圖1）。

2.2 ZYBS對dAMD大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響

6 組間視網(wǎng)膜凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=291.813，P=0.000）。兩兩比較：與CG 組比較，MG組大鼠視網(wǎng)膜凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=59.619，P=0.000）；與MG組比較，VE、LZYBS、MZYBS 和HZYBS 組大鼠視網(wǎng)膜凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tVE=15.405，tLZYBS=9.157，tMZYBS=7.750，均P=0.000；tHZYBS=4.190，P=0.001）（圖2、表1）。

表1 ZYBS對dAMD大鼠細胞凋亡和血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（，n=10）

表1 ZYBS對dAMD大鼠細胞凋亡和血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（，n=10）

注：*與CG 組比較，P＜0.05；#與MG 組比較，P＜0.05；CG 對照組；MG 模型組；VE 維生素E 組；LZYBS、MZYBS、HZYBS 低、中、高劑量ZYBS組；ZYBS 滋陰補腎片；dAMD 干性年齡相關(guān)性黃斑變性；ROS 活性氧；MDA 脂質(zhì)過氧化物丙二醛；SOD 超氧化物歧化酶；GSH-Px 谷胱甘肽過氧化物酶

2.3 ZYBS對dAMD大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

6 組間大鼠血清ROS、MDA、SOD 和GSH-Px 表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（FROS=250.702，F(xiàn)MDA=229.167，F(xiàn)SOD=81.506，F(xiàn)GSH-Px=63.499，均P=0.000）。兩兩比較，（1）ROS：與CG 組比較，MG 組大鼠血清ROS 水平升高（t=25.662，P=0.000）；與MG 組比較，VE、LZYBS、MZYBS、HZYBS 組大鼠血清ROS水平降低（tVE=18.093，tLZYBS=8.389，tMZYBS=26.990，均P=0.000；tHZYBS=3.097，P=0.006），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）MDA：與CG 組比較，MG 組大鼠血清MDA 水平升高（t=25.165，P=0.000）；與MG 組比較，VE、LZYBS、MZYBS、HZYBS 組大鼠血清MDA 水平降低（tVE=34.440，tLZYBS=21.221，tMZYBS=23.520，tHZYBS=29.590，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（3）SOD：與CG組比較，MG組大鼠血清SOD水平降低（t=11.401，P=0.000）；與MG 組比較，VE、LZYBS、MZYBS、HZYBS 組大鼠血清SOD 水平升高（tVE=21.430，tLZYBS=16.192，tMZYBS=26.092，tHZYBS=15.931，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（4）GSH-Px：與CG 組比較，MG 組大鼠血清GSH-Px 水平降低（t=14.677，P=0.000）；與MG 組比較，VE、LZYBS、MZYBS、HZYBS 組大鼠血清GSH-Px 水平升高（tVE=15.762，tLZYBS=10.727，tMZYBS=7.008，均P=0.000；tHZYBS=2.247，P=0.037），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

3 討論

AMD 的典型病理變化，包括氧化應(yīng)激和炎癥引起的RPE 損傷和脂褐素沉積，目前普遍認為AMD的發(fā)生是易感基因、炎癥反應(yīng)、RPE 細胞氧化損傷、老化和代謝改變等多種因素參與的[10]。但是無論是衰老、光損傷還是吸煙，其中的氧化應(yīng)激被認為是dAMD 的主要發(fā)病機制[10-11]。當(dāng)各種因素引起氧化損傷時，視網(wǎng)膜產(chǎn)生大量的ROS，溶酶體結(jié)構(gòu)受到破壞，RPE 細胞吞噬能力下降，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，可以產(chǎn)生超氧負離子、單態(tài)氧和H2O2等ROS，對RPE細胞造成損傷，并最終導(dǎo)致RPE 細胞的死亡，形成脂褐質(zhì)，堆積在RPE 層和Bruch 膜下，參與玻璃膜疣的形成。維持適當(dāng)?shù)腞PE 功能是治療dAMD 的主要治療目標(biāo)。針對dAMD發(fā)病機制中的氧化損傷因素，本研究利用鼠尾靜脈注射NaIO3進行造模，NaIO3是一種無機氧化劑，可引起視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激反應(yīng)，會先后引起RPE、感光細胞和內(nèi)層視網(wǎng)膜的損傷，是目前dAMD 研究使用較多的一種模型[7-8]。針對該模型中氧化損傷因素，本研究參照文獻[12]，選用具有抗氧化作用的維生素E 治療做為陽性對照藥。

中醫(yī)學(xué)認為AMD屬于“視瞻昏渺”的范疇，其本質(zhì)是由臟腑精氣不足所致，與腎、脾、肝關(guān)系最為密切。ZYBS 秉承“滋陰補腎健脾”的治則來治療dAMD，此方中有熟地黃、制首烏、桑椹、女貞子、生地黃、白芍、山藥、麥冬、五味子、澤瀉，共10 味藥。ZYBS 方中君藥為熟地黃、制首烏，可滋陰補腎；臣藥為桑椹、女貞子、生地黃、白芍，桑椹、女貞子兼為補陰藥，兩藥合用，可增補陰益肝腎之功；白芍益陰養(yǎng)血；生地黃滋陰生津；方中山藥、麥冬、五味子為佐藥，補脾胃，使升發(fā)肅降功能正常運行而使水谷精微布散周身，因此目得水谷精微濡養(yǎng)；澤瀉為方中使藥，有利濕瀉濁之功效，使方中補中有瀉，諸藥調(diào)和。已有實驗[13-17]證實熟地黃、女貞子具有抗氧化、抗炎和脂質(zhì)代謝多種藥理作用。

本實驗通過視網(wǎng)膜病理切片觀察，MG組40 mg/kg的NaIO3造成了明顯的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損傷，在視網(wǎng)膜全層及RPE 層均可看到凋亡細胞，細胞凋亡率增高。與MG 組比較，ZYBS 治療后，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列相對規(guī)整，視網(wǎng)膜外層感光細胞層數(shù)以及細胞核密度較MG組有不同程度改善，同時，TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜細胞凋亡率減少，提示ZYBS 對視網(wǎng)膜細胞凋亡有一定保護作用。本研究還發(fā)現(xiàn)ZYBS 在中劑量時能較好地降低大鼠視網(wǎng)膜的凋亡，而高劑量組細胞凋亡率高于中劑量組，推測ZYBS 部分中藥可能存在炮制不當(dāng)?shù)膯栴}（如制首烏），大劑量給藥后引起了細胞毒性，其中原因還有待進一步深入研究。

在氧化損傷中，GSH-Px 可以催化還原H2O2和其他過氧化物，而SOD 可以將氧離子催化還原為H2O2，MDA 是脂質(zhì)過氧化氫的終產(chǎn)物，這幾個指標(biāo)被廣泛用于氧化損傷的檢測。本研究檢測了大鼠血清中ROS 和MDA 的含量，發(fā)現(xiàn)與CG 組相比，MG組大鼠視網(wǎng)膜血清內(nèi)ROS和MDA水平升高，SOD和GSH-Px 水平降低，表明NaIO3誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜存在氧化應(yīng)激狀態(tài)。而給藥ZYBS 后，與MG 組相比，ZYBS 各劑量組降低了大鼠血清內(nèi)的ROS 水平。低、中劑量ZYBS 還可降低ROS 及MDA 水平，提示ZYBS 改善了NaIO3誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激狀態(tài)，減少ROS 及各種氧自由基對大鼠視網(wǎng)膜的損傷。

綜上所述，本實驗明確了ZYBS 可降低NaIO3誘導(dǎo)的dAMD 大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的損傷改變，抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激水平，可為dAMD的臨床藥物開發(fā)提供參考。