顏世舉，董文靜，李志銳，趙燕鵬，韓 濤，魏均強(qiáng)，王俊良，林 峰

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病[1]，其病情進(jìn)展與年齡呈正相關(guān)。中老年人發(fā)病率較高[2]，對(duì)生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響，且是致畸致殘的重要因素[3]。細(xì)胞自噬(autophagy)是真核細(xì)胞中廣泛存在的分解再利用系統(tǒng)，具有高度保守性[4]。自噬通過(guò)清除、降解受損細(xì)胞器或功能失調(diào)的大分子，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，高效利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞生存[5]。研究表明，自噬對(duì)于維持軟骨組織新陳代謝的平衡具有重要作用，軟骨細(xì)胞自噬水平降低是OA的重要病理變化標(biāo)志之一，并參與了OA的發(fā)生與發(fā)展[6]。

microRNA即微小RNA，是一類(lèi)高度保守的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)[7]。microRNA不參加基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，可與下游目標(biāo)靶基因mRNA 中3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)特異性結(jié)合，分解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA蛋白翻譯過(guò)程，起到基因沉默的作用[8]。目前關(guān)于OA相關(guān)特異性microRNA及其靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已有報(bào)道[9, 10]，同時(shí)研究表明，microRNA-22在OA軟骨組織、關(guān)節(jié)液中異常高表達(dá)[11, 12]，但其具體作用機(jī)制尚不十分清楚。因此本研究聚焦microRNA-22對(duì)軟骨細(xì)胞自噬的影響，進(jìn)而探討其在OA發(fā)病中的作用，為臨床診斷及治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 OA軟骨組織取自解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院骨科因重度OA行人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者術(shù)中膝關(guān)節(jié)軟骨，共14例。健康軟骨組織取自外傷行截肢術(shù)患者術(shù)中膝關(guān)節(jié)軟骨，共12例。每例軟骨標(biāo)本均獲得患者完全知情同意。

1.2 試劑及儀器 Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶(Millipore，美國(guó))，Taqman微小RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taqman MicroRNA assays(Applied Biosystems，美國(guó))，Lipofectamine 2000 (Life technologies, 美國(guó))，miR-22模擬物、抑制物(廣州銳博)，LC3B抗體、Collagen Ⅱ(COL2A1)抗體、GAPDH抗體(Cell Signaling Tech，美國(guó))，結(jié)晶紫(南京凱基)。

1.3 人軟骨細(xì)胞獲取與培養(yǎng) 無(wú)菌條件下獲取人軟骨組織，去除滑膜、結(jié)締組織等雜質(zhì)，在超凈臺(tái)中切碎至1 mm3大小顆粒，PBS沖洗后0.25%胰蛋白酶于37 ℃培養(yǎng)箱消化30 min，PBS沖洗后加入0.2%Ⅱ型膠原酶于37 ℃恒溫?fù)u床中緩慢搖動(dòng)孵育12 h，濾網(wǎng)過(guò)濾后，PBS沖洗，1000 r/min，離心5 min，棄去上清，以含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液混勻，將軟骨細(xì)胞以2×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2飽和濕度、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h更換培養(yǎng)液1次，同時(shí)觀察原代軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。待軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度80%時(shí)按1∶3傳代培養(yǎng)。

1.4 熒光定量PCR microRNA-22在健康、OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平 待健康軟骨細(xì)胞、OA軟骨細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用Trizol裂解液從軟骨細(xì)胞中提取總mRNA。取1 μg總RNA，使用Taqman微小RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，Taqman MicroRNA assays試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。擴(kuò)增程序設(shè)置：(1)Tap酶激活：95 ℃，10 min；(2)擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃，15 s；60 ℃，60 s。以小核RNA U6為管家基因，采用2-△△Ct法計(jì)算microRNA-22在正常軟骨細(xì)胞、OA軟骨細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 Western blot檢測(cè)健康、OA軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ的表達(dá)及其比值LC3B-Ⅱ/Ⅰ 待健康軟骨細(xì)胞、OA軟骨細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液裂解軟骨細(xì)胞，獲取總蛋白；配制SDS-PAGE蛋白凝膠，取等量蛋白，上樣，設(shè)置恒壓80 V電泳蛋白樣品；設(shè)置恒壓100 V、90 min轉(zhuǎn)膜，使用含有5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉90 min，并與LC3B一抗、GAPDH一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗，與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下孵育1 h，TBST清洗，加入顯色底物;采用Image J圖像分析軟件，獲取、分析各組條帶灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)microRNA-22對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響 將軟骨細(xì)胞分為空白組、miR-22模擬物組、miR-22抑制物組，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行Lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染，三組軟骨細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-22陰性對(duì)照、模擬物、抑制物序列，轉(zhuǎn)染序列終濃度為100 nM。轉(zhuǎn)染12 h后棄去轉(zhuǎn)染體系，更換為10% FBS完全培養(yǎng)液，繼續(xù)恒溫細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，胰蛋白消化、收集細(xì)胞，將三組細(xì)胞接種在6孔板中，300個(gè)/孔，使用10% FBS完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。14 d后，室溫下甲醇固定20 min，PBS清洗后以結(jié)晶紫染液室溫下染色20 min，顯微鏡下拍照，并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.7 Western blot檢測(cè)microRNA-22對(duì)軟骨細(xì)胞自噬的影響 將軟骨細(xì)胞分為空白組、miR-22模擬物組、miR-22抑制物組，采用上述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染三組軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后棄去轉(zhuǎn)染體系，更換為10% FBS完全培養(yǎng)液，繼續(xù)恒溫細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，胰蛋白消化、收集細(xì)胞，將三組細(xì)胞接種在6孔板中，1×105個(gè)/孔，待軟骨細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液輕輕清洗2次，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Collagen Ⅱ的表達(dá)水平，方法同前所述。

2結(jié) 果

2.1 microRNA-22在健康、OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，OA軟骨細(xì)胞中microRNA-22表達(dá)含量(2.50±0.39)顯著增高，約為健康軟骨細(xì)胞(0.98±0.25)的2.5倍，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 健康、OA軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ的表達(dá) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與健康軟骨細(xì)胞相比，OA軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B的Ⅱ類(lèi)亞型含量顯著降低(圖1)；OA軟骨細(xì)胞(4例)LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值為1.25±0.13，健康軟骨細(xì)胞(4例)LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值為1.85±0.21，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 骨關(guān)節(jié)炎自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ、Ⅰ在健康、

2.3 microRNA-22對(duì)軟骨細(xì)胞克隆形成能力的影響 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組(107.33±14.3)相比，軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22模擬物后，細(xì)胞克隆形成數(shù)量(75.67±11.36)顯著降低(P<0.01)；與空白對(duì)照組相比，軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22抑制物后，細(xì)胞克隆形成數(shù)量(128.5±9.95)顯著增高(P<0.05，圖2)。

圖2 骨關(guān)節(jié)炎microRNA-22對(duì)軟骨細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.4 microRNA-22對(duì)軟骨細(xì)胞自噬及OA發(fā)生發(fā)展的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，miR-22模擬物組軟骨細(xì)胞中LC3B-Ⅱ含量顯著降低，LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值降低，Ⅱ型膠原Collagen Ⅱ的表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-22抑制物組軟骨細(xì)胞中LC3B-Ⅱ含量顯著增高，LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值增高，同時(shí)Ⅱ型膠原Collagen Ⅱ的表達(dá)水平增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 骨關(guān)節(jié)炎microRNA-22對(duì)軟骨細(xì)胞自噬的影響

表1 骨關(guān)節(jié)炎microRNA-22對(duì)軟骨細(xì)胞自噬的影響

注：與空白對(duì)照組相比，①P<0.05

組別LC3B-ⅠLC3B-ⅡLC3B-Ⅱ/ LC3B-ⅠCollagen Ⅱ空白對(duì)照組1.01±0.031.92±0.111.90±0.140.98±0.09miR-22模擬物組1.03±0.081.50±0.20①1.45±0.13①0.51±0.09①miR-22抑制物組1.02±0.072.36±0.19①2.30±0.08①1.31±0.03①

3討 論

OA是最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，病變主要累及膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)等負(fù)重關(guān)節(jié)，亦常見(jiàn)于指間關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)等活動(dòng)關(guān)節(jié)[13]。OA臨床主要表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)進(jìn)行性疼痛、腫脹，關(guān)節(jié)間隙變窄，骨贅生物形成，活動(dòng)受限等[14]。目前認(rèn)為，關(guān)節(jié)軟骨退變、分解是骨關(guān)節(jié)主要的病理改變之一[15]。軟骨細(xì)胞是軟骨組織中唯一存在的細(xì)胞類(lèi)型，對(duì)于維持生理?xiàng)l件下軟骨組織合成與分解代謝的穩(wěn)態(tài)具有重要意義[16]。在OA發(fā)病過(guò)程中，各種致病因素共同作用下，軟骨細(xì)胞合成的Ⅱ型膠原等功能蛋白減少并且結(jié)構(gòu)異常，功能受損，正常細(xì)胞表型逐漸丟失，無(wú)法維持軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)了OA的發(fā)生與發(fā)展[17]。因此，本研究聚焦關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，通過(guò)胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶序貫消化軟骨基質(zhì)，獲得健康、OA原代軟骨細(xì)胞，應(yīng)用于后續(xù)研究可最大限度模擬人體內(nèi)環(huán)境。

microRNA是一類(lèi)非編碼單鏈RNA，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，在進(jìn)化中高度保守。近年來(lái)研究表明，microRNA廣泛參與了骨關(guān)節(jié)發(fā)病與進(jìn)展，受到廣泛關(guān)注。在大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型中，上調(diào)miR-29a可通過(guò)TLR4/Myd88/NF-κB信號(hào)通路失活化抑制大鼠滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)，保護(hù)滑膜損傷，延緩OA進(jìn)展[18]。Yan等[10]報(bào)道，microRNA-34a通過(guò)抑制SIRT1/P53通路，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，參與了OA發(fā)病。文獻(xiàn)[11, 12]報(bào)道，microRNA-22在OA軟骨組織、關(guān)節(jié)液中異常高表達(dá)，提示microRNA-22可能參與了OA發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)，研究表明microRNA-22在多種疾病中可調(diào)控細(xì)胞自噬[19, 20]，由此我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究方案，探索microRNA-22對(duì)軟骨細(xì)胞自噬的影響，進(jìn)而初步闡釋microRNA-22在OA發(fā)病機(jī)制中的重要作用。

通過(guò)檢測(cè)microRNA-22在健康、軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)microRNA-22在OA軟骨細(xì)胞中異常高表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)健康、OA軟骨細(xì)胞中自噬水平，發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞中自噬水平受到抑制。因此我們認(rèn)為，microRNA-22可能通過(guò)調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬，促進(jìn)OA的發(fā)生與發(fā)展。

細(xì)胞自噬是一種自我降解的過(guò)程，真核細(xì)胞通過(guò)降解異常狀態(tài)的細(xì)胞器、大分子，以維持細(xì)胞正常的新陳代謝[21]。研究表明，生理水平的細(xì)胞自噬對(duì)于軟骨細(xì)胞維持軟骨組織正常生理功能具有十分重要的意義，同時(shí)在體內(nèi)軟骨細(xì)胞自噬水平隨著年齡增加而衰減[22]。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)轉(zhuǎn)染microRNA-22模擬物、抑制物，上調(diào)、下調(diào)軟骨細(xì)胞中microRNA-22的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染microRNA-22模擬物可抑制軟骨細(xì)胞自噬，同時(shí)抑制軟骨細(xì)胞特征性蛋白—Ⅱ型膠原的表達(dá)；與之相反，轉(zhuǎn)染microRNA-22抑制物可促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬，同時(shí)促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)，提示microRNA-22通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞自噬，參與了OA的發(fā)病與進(jìn)展。

文獻(xiàn)[23]研究表明，軟骨組織損傷時(shí)，軟骨細(xì)胞會(huì)進(jìn)入增殖狀態(tài)，以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的不利因素，維持軟骨組織代謝平衡，從而發(fā)揮軟骨的生理功能。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染microRNA-22模擬物可抑制軟骨細(xì)胞克隆形成能力，轉(zhuǎn)染microRNA-22抑制物可促進(jìn)軟骨細(xì)胞克隆形成，提示microRNA-22可抑制軟骨細(xì)胞增殖能力，在OA發(fā)病中起到重要作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)microRNA-22在OA軟骨中異常高表達(dá)，OA軟骨細(xì)胞中自噬水平受到抑制，與此同時(shí)，上調(diào)軟骨細(xì)胞中microRNA-22水平可抑制軟骨細(xì)胞自噬，抑制軟骨細(xì)胞增殖能力，抑制軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原合成，促進(jìn)OA發(fā)病。由此可見(jiàn)，microRNA-22可作為OA潛在的臨床診斷的特征性分子和治療靶點(diǎn)，受到進(jìn)一步關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)僅在體外細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)行了探索，仍需進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。