張利通 李冉 許紅旗 梁洪磊

安陽市人民醫(yī)院神經(jīng)外科（河南 安陽 455000）

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤（intracranial aneurysms）是多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤在人群中的發(fā)病率為3.2%[1]，一旦破裂就會導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血，生存率低，并且伴有嚴(yán)重的后遺癥[2]。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤每年的破裂率為1%，大部分顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者終身未破裂[3]。全基因組分析證實(shí)了一些基因位點(diǎn)與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成相關(guān)[4-5]。多中心研究結(jié)果重復(fù)定位在染色體9p21上的基因位點(diǎn)：CDKN2A/B；該基因突變與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[6]，但是這些研究并沒有深入研究顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成的遺傳機(jī)制。

CDKN2A為細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2A，CDKN2B為細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2B，這兩個(gè)基因編碼p16INK4a（CDKN2A的外顯子1α，2和3編碼），p14ARF（CDKN2A的外顯子1β，2編碼），p15INK4a（CDKN2B編碼）。有研究表明，從鼠身上分離出血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)CDKN2A/B的表達(dá)，會引起平滑肌細(xì)胞的過度增殖或凋亡[7]。平滑肌細(xì)胞在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生中起著重要作用，因此這個(gè)發(fā)現(xiàn)很可能提示CDKN2A/B和顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成的潛在關(guān)系。但是國內(nèi)外尚沒有在動(dòng)物或人體動(dòng)脈瘤壁組織中探索該基因的突變在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成過程中的作用。因此，本文旨在探索該基因參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成中的具體機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象病例組為安陽市人民醫(yī)院神經(jīng)外科在2017-2021年間行開顱夾閉顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的過程成功取下動(dòng)脈瘤壁組織的82例患者；對照組為本院同期收治的114例入院頭CTA檢查無顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的頭外傷患者。病例組：男41例，女41例，年齡（53.34±11.420）歲，高血壓42例，高血脂28例，糖尿病12例；對照組：男65例，女49例，年齡（51.17±10.519）歲，高血壓46例，高血脂38例，糖尿病10例。

1.2 方法82例離體瘤壁組織被液氮迅速冷凍，并保存于-80℃冰箱。因1例組織過小實(shí)驗(yàn)中未得到相應(yīng)圖片及數(shù)據(jù)，有效標(biāo)本為81例。使用免疫熒光顯示瘤壁中p15INK4b/p16INK4a蛋白的表達(dá)，通過熒光染色區(qū)域的比例對比不同基因型的表達(dá)量。每個(gè)研究對象均使用EDTA抗凝管留取2 mL靜脈血標(biāo)本，并提取DNA，選取CDKN2A/B相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms SNP）位點(diǎn)（rs1333040，rs700651，rs10757278，rs10757272，rs6475606）并進(jìn)行基因分型，選取的SNP位點(diǎn)均為既往全基因組分析以及文獻(xiàn)中報(bào)道與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤顯著相關(guān)的[5]。冰凍動(dòng)脈瘤壁組織中提取RNA，使用RT-PCR技術(shù)檢測動(dòng)脈瘤壁中p16INK4a，p15INK4b的表達(dá)水平，組織內(nèi) p16INK4a，p15INK4b蛋白表達(dá)量采用Western blot方法測定。每位患者均簽署知情同意書，并經(jīng)過安陽市人民醫(yī)院倫理委員會審查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在病例組和對照組之間對每個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Pearson檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法在病例組和對照組之間比較SNP位點(diǎn)基因頻率之間的差異，并計(jì)算位點(diǎn)的相對風(fēng)險(xiǎn)度比值比（OR）及其95%CI。計(jì)量資料以（）表示，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后（P＞0.05）采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)脈瘤壁組織表達(dá)p15INK4b/p16INK4a蛋白預(yù)實(shí)驗(yàn)通過對動(dòng)脈瘤壁組織進(jìn)行免疫熒光染色，可見p15INK4b/p16INK4a蛋白熒光染色，驗(yàn)證動(dòng)脈瘤壁組織內(nèi)表達(dá)p15INK4b/p16INK4a蛋白（圖1）。

2.2 病例組和對照組的臨床特征分析兩組年齡、性別、高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙、飲酒等相關(guān)特征，結(jié)果兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1，進(jìn)一步對兩組間相關(guān)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析。

表1 病例組和對照組的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of case group and control group 例（%）

2.3 SNP與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的關(guān)聯(lián)分析使用114例對照組及82例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者外周血，提取DNA，對CDKN2A/B相關(guān)基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，在兩組間行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，rs10757272位點(diǎn)等位基因T的頻率高于對照組（P=0.029，OR=1.658，95%CI：1.051 ～ 2.614）。其余的基因位點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 病例組和對照組SNP基因型和等位基因頻率Tab.2 SNP genotypes and allele frequencies in patients and controls例（%）

2.4 rs10757272位點(diǎn)基因型與CDKN2A/B的表達(dá)水平之間的關(guān)系在81例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤壁組織中，研究rs10757272位點(diǎn)基因型與CDKN2A/B的表達(dá)水平之間的關(guān)系，可以觀察到該SNP位點(diǎn)不同基因型的p16INK4a、p15INK4bmRNA水平有差異，在T/T基因型中p16INK4amRNA低水平轉(zhuǎn)錄（P＜0.01），p15INK4mRNA也為低水平轉(zhuǎn)錄（P=0.014）。在T/T基因型中在p15INK4b蛋白為低水平表達(dá)（P=0.027），p16INK4a蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.089），但是有相似的低表達(dá)趨勢（圖2）。

2.5 免疫熒光對比rs10757272位點(diǎn)不同基因型與p16INK4a，p15INK4b在動(dòng)脈瘤壁中表達(dá)水平進(jìn)一步驗(yàn)證rs10757272位點(diǎn)不同基因型與p16INK4a，p15INK4b在動(dòng)脈瘤壁中表達(dá)水平的關(guān)系，采用免疫熒光的方法標(biāo)記動(dòng)脈瘤壁，計(jì)算平滑肌細(xì)胞染色區(qū)域中p16INK4a，p15INK4b各自染色所占比例，結(jié)果顯示有T等位基因的SNP基因型p15INK4b低比例染色區(qū)域（P=0.037），p16INK4a差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.065）（圖3、4）。

推測9p21區(qū)域的相關(guān)突變SNP位點(diǎn)通過調(diào)節(jié)CDKN2A/B基因的表達(dá)，引起p15和p16的改變，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D（cyclin D）與CDK4、CDK6不能發(fā)生相互作用。cyclin D-CDK4/6復(fù)合物不能被激活，使相關(guān)蛋白不能磷酸化，進(jìn)而使轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物Rb-E2F不能解聚，不能釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子，從而細(xì)胞不能增殖，并進(jìn)入凋亡階段。

3 討論

全基因組和一些可重復(fù)性研究表明，位于9p21染色體上的CDKN2A/B基因位點(diǎn)突變是動(dòng)脈瘤發(fā)生的主要因素。CDKN2A/B編碼p16INK4a和p15INK4a，分別是CDK4（細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶4）和CDK5（細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5）的抑制因子，其定位于染色體9p21。其通過抑制E2F，從而抑制E2F介導(dǎo)的細(xì)胞增殖基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的基因，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞增殖方面起著重要的作用[8-10]。在純合子風(fēng)險(xiǎn)基因患者的動(dòng)脈粥樣硬化板塊中分離出的平滑肌細(xì)胞提示p16和p15蛋白表達(dá)減少、細(xì)胞增殖增加；敲除大鼠9p21同源序列基因后發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中CDKN2A/B的表達(dá)減少，平滑肌細(xì)胞的增殖明顯增加，并且無法進(jìn)入凋亡階段[7]。一些研究結(jié)果同樣表明，該基因通過細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子抑制血管壁的平滑肌細(xì)胞增殖[11-13]。但尚不清楚它們是否在人類血管系統(tǒng)中發(fā)揮類似的作用。

以前相關(guān)研究中均為外周血有核細(xì)胞中提取DNA研究相關(guān)位點(diǎn)的突變與動(dòng)脈瘤的相關(guān)性[14]。但本研究為了探索相關(guān)位點(diǎn)的突變與動(dòng)脈瘤發(fā)生的潛在機(jī)制，研究的是不同基因型顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者離體動(dòng)脈瘤瘤壁中相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成上的差異。本文中所選SNP位點(diǎn)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)rs10757272在兩組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，筆者認(rèn)為該位點(diǎn)與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤顯著相關(guān)。并且在國外報(bào)道中不同的人群和種族中得出相同的結(jié)論：rs10757272位點(diǎn)與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤之間存在顯著關(guān)聯(lián)[5]。LI等[15]針對中國人群的研究中得出rs10757272與IA顯著相關(guān)；有關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為該位點(diǎn)與冠狀動(dòng)脈疾病顯著相關(guān)[16-17]。為進(jìn)一步探索該SNP位點(diǎn)突變與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成的潛在機(jī)制，進(jìn)一步分析rs10757272位點(diǎn)不同的基因型與動(dòng)脈瘤壁組織內(nèi)CDKN2A/B的表達(dá)水平的關(guān)系。通過檢測動(dòng)脈瘤壁組織中基因表達(dá)產(chǎn)物p15INK4a、p16INK4a的水平，發(fā)現(xiàn)rs10757272位點(diǎn)的不同基因型與CDKN2A/B的表達(dá)水平上存在差異。尤其是本研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)TT基因型上動(dòng)脈瘤壁中p15INK4a為低水平的表達(dá)，p16INK4a為低表達(dá)趨勢。rs10757272位點(diǎn)基因型與p15INK4a、p16INK4a的表達(dá)水平相關(guān)，在T等位基因上p15INK4a的低表達(dá)，在C等位基因上表達(dá)較高。p15INK4a/p16INK4a在不同基因型中的表達(dá)的差異，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的塑性，平滑肌細(xì)胞的塑性在動(dòng)脈血管病變中起著關(guān)鍵作用，如在動(dòng)脈硬化的形成過程中扮演重要角色[18-20]。平滑肌細(xì)胞的塑性亦可導(dǎo)致血管壁的順應(yīng)性下降，可能為動(dòng)脈瘤形成的重要因素。并且在不同的基因型患者中，動(dòng)脈瘤壁中的CDKN2B轉(zhuǎn)錄的mRNA有顯著的差異，并且在相應(yīng)的蛋白水平上存在差異，因此本研究認(rèn)為該位點(diǎn)的突變會引起顱內(nèi)動(dòng)脈血管壁平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)的變化，在外界因素的干預(yù)下導(dǎo)致動(dòng)脈瘤的形成。

本研究以IA患者的離體動(dòng)脈瘤瘤壁作為研究對象，直接探索了rs10757272位點(diǎn)不同基因型在瘤壁內(nèi)的表達(dá)水平，但本研究結(jié)果只是初步探索SNP位點(diǎn)不同基因型與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤之間的潛在機(jī)制，不能從動(dòng)態(tài)上了解該位點(diǎn)參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成過程中的具體機(jī)制，需進(jìn)一步行細(xì)胞培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)了解其參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成具體過程。