李俊彥 余夢擎 楊琳琳 蔡鈺瑩 李友 楊宇

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1老年醫(yī)學(xué)科，2急診醫(yī)學(xué)中心，3神經(jīng)病學(xué)研究所（廣東 湛江 524000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種主要引起癡呆的神經(jīng)退行性疾病，其特征是進(jìn)行性記憶力下降，常伴有執(zhí)行、語言和（或）視覺空間功能的缺陷以及行為改變，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡[1-2]。AD是一種緩慢且不可逆的，但進(jìn)行性、復(fù)雜和多因素的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年人群癡呆的最常見原因。65歲后患AD的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，超過85歲的人群患AD的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)30%[3-4]。

目前，AD的病因尚未完全明確。神經(jīng)炎癥、細(xì)胞外以β淀粉樣蛋白為主要蛋白組分的老年斑和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)是AD的關(guān)鍵病理標(biāo)志物。AD主要特征是皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元丟失，以及關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)通路的進(jìn)行性退化[5-6]。MicroRNAs是0生物體內(nèi)源性的小RNA分子，長度為19～23個(gè)堿基對。大量研究發(fā)現(xiàn)microRNAs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的含量非常豐富，它們在神經(jīng)細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、凋亡，神經(jīng)元遷移及突觸塑形過程中扮演了非常重要的角色，從而參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[7-9]。LEE等[10]報(bào)道了AD患者顳葉皮層的腦組織microRNA-206表達(dá)水平明顯升高。國內(nèi)學(xué)者林曉光[11]研究發(fā)現(xiàn)microRNA-206通過調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而參與AD的發(fā)病。

編碼人microRNA-206基因位于6號染色體短臂1區(qū)2帶（6p12），含有1個(gè)外顯子[12-13]。WANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)microRNA-206基因上游啟動(dòng)子區(qū)域rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與BDNF基因rs6265位點(diǎn)多態(tài)性存在密切的交互作用，這種交互作用會(huì)增加雙相情感障礙發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)?；谏鲜鲅芯?，我們推測microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性可能與AD的發(fā)病有關(guān)。迄今為止，從分子遺傳學(xué)角度研究microRNA-206基因多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系尚沒有國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以中國人群為對象，首次分析microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系，并比較AD患者與健康者外周血microRNA-206表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步探討rs16882131位點(diǎn)不同基因型與microRNA-206表達(dá)水平的關(guān)系。這為闡明microRNA-206基因多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系提供強(qiáng)有力的依據(jù)，為AD的診治提供新的線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象以2017年1月至2021年6月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科門診或住院的100例AD患者（病例組）為研究對象。AD的診斷參照1984年美國國立神經(jīng)病、語言機(jī)能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關(guān)疾病協(xié)會(huì)（National Institute of Neurological and Communicative Diseases and Stroke/Alzheimer Disease and Related Disorders Association，NINCDS-ADRDA）制定的標(biāo)準(zhǔn)[15]并且符合2011年美國國立老化研究所和阿爾茨海默協(xié)會(huì)對此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂的“很可能的AD”的核心臨床標(biāo)準(zhǔn)。病例組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其他類型的癡呆。（2）既往有精神障礙性疾病。（3）既往有影響神經(jīng)系統(tǒng)功能的疾病者，如自身免疫性腦炎等。對照組選自廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心同期體檢的健康者100例。對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）簡易精神狀態(tài)量表（MMSE）評分＜ 28分。（2）認(rèn)知能力和日常生活能力下降。（3）有癡呆家族史或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病史者。（4）既往有精神障礙性疾病。兩組研究對象均為無血緣關(guān)系的中國人群。本研究已通過廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。兩組的一般臨床資料詳見表1。

表1 兩組一般臨床資料比較Tab.1 The comparison of the general clinical information between the two groups ±s

表1 兩組一般臨床資料比較Tab.1 The comparison of the general clinical information between the two groups ±s

臨床資料年齡（歲）性別（男/女，例）吸煙史（例）受教育年限（年）MMSE評分病例組（n=100）68.36±9.34 43/57 36 9.51±1.42 11.95±2.35對照組（n=100）67.58±9.15 46/54 33 9.62±1.45 28.27±2.56 t/χ2值0.597 0.182 0.199 0.542 46.96 P值0.552 0.669 0.655 0.588＜0.001

1.2 基因型檢測采用乙二胺四乙酸鈉抗凝管收集兩組研究對象空腹外周靜脈血2 mL，按照北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取兩組研究對象外周血全基因組DNA。運(yùn)用SNaPshot技術(shù)[16]對兩組研究對象的microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測，主要操作步驟包括：多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、單堿基延伸反應(yīng)以和多態(tài)性位點(diǎn)的測定。其中rs16882131位點(diǎn)PCR上游引物序列：5'-ATGCACAAAAACAGCAGCAG-3'；下游引物序列：5'-GAAAAACCTTTGGGGGAAAG-3'。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞總microRNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用密度梯度離心法提取兩組研究對象外周血單個(gè)核細(xì)胞，并根據(jù)RNA提取試劑盒操作步驟提取單個(gè)核細(xì)胞總microRNA。按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將單個(gè)核細(xì)胞總microRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)熒光定量試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀操作步驟檢測兩組研究對象microRNA-206的表達(dá)水平，以U6作為microRNA-206內(nèi)參定量產(chǎn)物濃度。每個(gè)cDNA樣本重復(fù)檢測3次實(shí)時(shí)熒光定量PCR，運(yùn)用2-ΔΔCt值計(jì)算兩組研究對象microRNA-206的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)兩組的基因型頻率和等位基因頻率；采用哈迪-溫伯格定律對兩組進(jìn)行遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)；兩組基因型頻率和等位基因頻率分布的比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。本研究數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0軟件分析，均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率分布比較病例組和對照組的microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)的基因型頻率分布均符合哈迪-溫伯格定律（P＞0.05），提示兩組納入的研究對象具有良好的群體代表性。病例組microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)的CC、CT和TT基因型頻率分別是44.0%、38.0%和18.0%，對照組分別是59.0%、34.0%和7.0%，兩組基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CCvs.CTvs.TT：P=0.027；顯性模型TT+CTvs.CC：P=0.034，OR=1.831，95%CI：1.045 ～ 3.209）；病例組microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)T等位基因頻率明顯高于對照組（37.0%vs.24.0%，P=0.005，OR=1.860，95%CI：1.206 ～ 2.868），見表2。

表2 兩組microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較Tab.2 The comparison of the genotype and allele frequencies of the SNP rs16882131 in the microRNA-206 gene between the two groups 例（%）

2.2 兩組外周血microRNA-206表達(dá)水平的比較和rs16882131位點(diǎn)對microRNA-206表達(dá)水平的影響病例組的microRNA-206相對表達(dá)量明顯高于對照組[（1.85± 0.24）vs.（0.99± 0.18）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。對照組rs16882131位點(diǎn)的基因型與microRNA-206表達(dá)水平的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)TT+CT基因型（T等位基因攜帶）的microRNA-206相對表達(dá)量明顯高于CC基因型[（1.33±0.19）vs.（0.75±0.17）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

3 討論

AD是一種進(jìn)行性且不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年人中最常見的癡呆形式。AD可分為3個(gè)階段：（1）臨床前期，通常沒有出現(xiàn)臨床癥狀，有生物學(xué)標(biāo)志物的早期改變。（2）前驅(qū)期，包括疾病的最早癥狀階段，即認(rèn)知能力下降開始明顯，而生物標(biāo)志物水平未達(dá)到診斷癡呆的截止標(biāo)準(zhǔn)。（3）病理和癥狀學(xué)完全發(fā)展的癡呆階段。目前認(rèn)為AD主要的病理基礎(chǔ)是淀粉蛋白前體蛋白異常斷裂、β淀粉蛋白沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)[17-19]。

β淀粉蛋白沉積和微管相關(guān)蛋白過度磷酸化是AD早期神經(jīng)退行性過程的關(guān)鍵致病因素，并且它們被認(rèn)為在突觸處局部相互作用，導(dǎo)致突觸功能障礙和認(rèn)知減退。越來越多的證據(jù)表明突觸中蛋白質(zhì)功能的改變可能參與AD的早期突觸改變[20-22]。近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)MicroRNAs可能通過改變突觸的結(jié)構(gòu)和功能從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性變[23-24]。眾所周知，BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子系統(tǒng)，它通過與其特異性受體酪氨酸受體激酶B6結(jié)合而對神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)作用。此外，BDNF是參與維持突觸可塑性和突觸發(fā)生的關(guān)鍵分子。有研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)microRNA-206會(huì)抑制BDNF的生成，進(jìn)一步引起突觸功能障礙和神經(jīng)退行性變，進(jìn)而參與AD的發(fā)病。由此可見，microRNA-206的異常表達(dá)與AD發(fā)病密切相關(guān)?；诖耍狙芯渴状畏治鰉icroRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系，并比較AD患者與健康者外周血microRNA-206表達(dá)水平的變化。

本研究發(fā)現(xiàn)AD患者microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)TT+CT基因型（T等位基因攜帶）和T等位基因頻率均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（56.0%vs.41.0%，P=0.034，OR=1.831；37.0%vs.24.0%，P=0.005，OR=1.860），提示T等位基因可能是AD易感性的危險(xiǎn)因素。此外，AD患者外周血microRNA-206表達(dá)水平明顯高于對照組?；谶@些發(fā)現(xiàn)，推斷microRNA-206基因多態(tài)性與AD易感性密切相關(guān)，并且外周血microRNA-206可作為AD的一種重要的生物學(xué)標(biāo)記物。值得一提的是，本研究還發(fā)現(xiàn)rs16882131位點(diǎn)T等位基因攜帶者的microRNA-206表達(dá)水平明顯高于CC基因型。rs16882131位點(diǎn)位于microRNA-206基因上游啟動(dòng)子區(qū)域，推測microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)T等位基因可能增加其啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性，引起microRNA-206基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而參與AD的發(fā)病。然而，rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與microRNA-206基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系需要更進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究去證實(shí)，這也是繼續(xù)開展研究的方向之一。

本研究尚存在一些不足地方。首先，本研究納入的總體研究對象樣本量相對偏小。其次，本研究只分析了microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系。因此，后續(xù)研究將會(huì)繼續(xù)增加病例對照組樣本量，更進(jìn)一步分析microRNA-206基因其余位點(diǎn)多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系。此外，在后續(xù)的研究中我們將會(huì)繼續(xù)尋找其他參與AD發(fā)病的基因，進(jìn)一步分析其多態(tài)性與不同人群AD易感性的關(guān)系。

綜上所述，microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與AD發(fā)病易感性有關(guān)，T等位基因可能通過上調(diào)microRNA-206的表達(dá)進(jìn)而引起AD。