恩歌 陳少杰 劉陽(yáng) 林祥燦

1天津北大醫(yī)療海洋石油醫(yī)院心內(nèi)科（天津 300452）；2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科（廣州 510120）；3南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科（湖南 衡陽(yáng) 421000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是臨床上多種心血管疾病終末階段的共同表現(xiàn)[1-2]，目前發(fā)病的分子機(jī)制尚未明確，相關(guān)的分子生物學(xué)研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）系統(tǒng)、交感系統(tǒng)的激活與CHF的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中炎癥反應(yīng)激活所致多種炎癥因子的異常釋放會(huì)造成心肌細(xì)胞損害、心肌間質(zhì)重構(gòu)。白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）是參與炎癥反應(yīng)激活的重要細(xì)胞因子，CHF患者血清中IL-8的水平明顯升高且與心功能減退、預(yù)后不良有關(guān)[3-4]，深入認(rèn)識(shí)IL-8在CHF發(fā)病中的作用及機(jī)制有助于進(jìn)一步闡明CHF的發(fā)病機(jī)制。

IL-8的生物學(xué)作用與下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的活化有關(guān)[5-6]。STAT3是在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在壓力負(fù)荷、缺血再灌注等病理因素誘導(dǎo)的CHF中均發(fā)生過(guò)度活化且參與心肌重構(gòu)、炎癥反應(yīng)的調(diào)控[7-8]。為了深入認(rèn)識(shí)IL-8在CHF發(fā)病中的作用及機(jī)制，本研究在野生型小鼠和特異性敲除心肌IL-8的模型小鼠中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，具體觀察IL-8通過(guò)STAT3對(duì)CHF小鼠心功能及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型（wild type，WT）C57BL/6J雄性小鼠購(gòu)自上海南方模式生物科技公司，特異性敲除（knockout，KO）心肌IL-8的雄性模式小鼠（遺傳背景C57BL/6J）由上海南方模式生物科技公司采用LoxP-Cre系統(tǒng)構(gòu)建并鑒定。

1.2 試劑與儀器蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal pro-B type natriuretic peptide，NT-proBNP）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定（ELISA）試劑盒上海原鑫生物科技公司，總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化公司，IL-8、STAT3、p-STAT3、β-actin特異性一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

6LAB便攜式小動(dòng)物超聲儀購(gòu)自北京益仁恒業(yè)科技有限公司，XD30M型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自浙江舜宇光學(xué)生物儀器公司，LineGene Mini型熒光定量PCR儀購(gòu)自杭州博日科技股份有限公司。

1.3 動(dòng)物分組及造模WT C57BL/6J雄性小鼠分為WT對(duì)照組、WT模型組，特異性心肌IL-8 KO的雄性模式小鼠分為KO對(duì)照組、KO模型組，每組各8只。WT模型組和KO模型組采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立CHF模型，方法如下：腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg，麻醉后打開(kāi)腹腔、暴露腹主動(dòng)脈，在主動(dòng)脈根部上方用3.0絲線穿無(wú)菌聚乙烯塑料管結(jié)扎；WT對(duì)照組和KO對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)操作，按照造模相同的方法麻醉、打開(kāi)腹腔、暴露腹主動(dòng)脈、穿線但不結(jié)扎。完成手術(shù)后關(guān)閉切口，4周后進(jìn)行檢測(cè)和取材。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能造模4周后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，而后擺放仰臥位，用多普勒探頭在胸骨旁的左室長(zhǎng)軸進(jìn)行掃描，獲得理想圖像后檢測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 血清的取材及檢測(cè)完成超聲心動(dòng)圖檢測(cè)后，經(jīng)心尖取血約2～3 mL，靜置30 min后凝血，3 000 r/min離心10 min，分離血清并采用ELISA試劑盒檢測(cè)NT-proBNP、IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平。

1.6 心肌的取材及稱(chēng)重完成經(jīng)心尖取血后解剖心臟、稱(chēng)量心臟質(zhì)量（heart weight，HW），解剖左心室、稱(chēng)量左心室質(zhì)量（left ventricle weight，LVW），同時(shí)在超聲心動(dòng)圖檢查檢測(cè)稱(chēng)量體質(zhì)量（body weight，BW），計(jì)算HW/BW、LVW/HW。

1.7 心肌病理改變的HE染色檢測(cè)剪取適量左心室的心肌組織，在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，而后進(jìn)行石蠟包埋、制作厚度4 μm的切片，進(jìn)行HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的病理改變。

1.8 心肌中蛋白表達(dá)水平的免疫印跡檢測(cè)剪取左心室的心肌組織約5～8 mg，加入預(yù)冷的裂解液并在冰上研磨組織，研磨后進(jìn)行4℃、12 000 r/min 10 min，吸取離心后的上清、BCA法檢測(cè)蛋白濃度。在免疫印跡檢測(cè)時(shí)，每份樣本取30 μg蛋白，在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，分離不同分子量的蛋白后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；而后分別進(jìn)行5%脫脂牛奶孵育，IL-8一抗、p-STAT3一抗、STAT3一抗、β-actin一抗孵育，辣根過(guò)氧化物酶二抗孵育，最后采用電化學(xué)發(fā)光法顯影得到蛋白條帶，用軟件分析條帶的灰度值，用目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值的比值來(lái)分析蛋白表達(dá)水平。

1.9 心肌中mRNA表達(dá)水平的PCR檢測(cè)剪取左心室的心肌組織約5～8 mg，采用總RNA提取試劑盒提取組織中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)組織中的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、合成cDNA，最后采用熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μL、熒光定量檢測(cè)反應(yīng)混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL、去離子水補(bǔ)足至20.0 μL。在熒光定量PCR以上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min后95℃ 15 s、特異性退火溫度（IL-1β 60.0℃、IFN-γ 62℃、TNF-α 60.0℃、β-actin 62.0℃）25 s、72℃ 30 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct），以β-actin為內(nèi)參、按照公式2-△△Ct計(jì)算IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料且符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，4組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠心肌中IL-8表達(dá)水平的免疫印跡檢測(cè)WT模型組小鼠心肌中IL-8的表達(dá)水平高于WT對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；KO對(duì)照組、KO模型組小鼠心肌中不表達(dá)IL-8。見(jiàn)圖1。

2.2 四組小鼠心功能的超聲心動(dòng)圖檢測(cè)四組小鼠LVEF、LVESD、LVEDD的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較如下：WT模型組小鼠的LVEF水平低于WT對(duì)照組，LVESD、LVEDD水平均高于WT對(duì)照組（P＜0.05）；KO對(duì)照組小鼠的LVEF、LVESD、LVEDD水平與WT對(duì)照組比較無(wú)差異（P＞0.05）；KO模型組小鼠的LVEF水平高于WT模型組，LVESD、LVEDD水平均低于WT模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 四組小鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)LVEF、LVESD、LVEDD的比較Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters LVEF，LVESD and LVEDD among four groups of mice ±s

表1 四組小鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)LVEF、LVESD、LVEDD的比較Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters LVEF，LVESD and LVEDD among four groups of mice ±s

注：與WT對(duì)照組比較，*P＜0.05；與WT模型組比較，#P＜0.05

例數(shù)8 8 8 8組別WT對(duì)照組WT模型組KO對(duì)照組KO模型組F值P值LVEF（%）66.92±5.41 45.41±4.52*66.29±4.95 56.71±5.09#13.282＜0.001 LVESD（mm）0.298±0.042 0.477±0.061*0.301±0.046 0.389±0.038#11.922＜0.001 LVEDD（mm）0.471±0.051 0.672±0.084*0.480±0.048 0.545±0.060#9.484＜0.001

2.3 四組小鼠血清中心衰標(biāo)志物NT-proBNP的Elisa檢測(cè)四組小鼠血清NT-proBNP水平的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較如下：WT模型組小鼠的血清NT-proBNP水平高于WT對(duì)照組（P＜0.05）；KO對(duì)照組小鼠的血清NT-proBNP水平與WT對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；KO模型組小鼠的血清NT-proBNP水平低于WT模型組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4 四組小鼠HW/BW、LVW/HW的比較四組小鼠HW/BW、LVW/HW的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較如下：WT模型組小鼠的HW/BW、LVW/HW高于WT對(duì)照組（P＜0.05）；KO對(duì)照組小鼠的HW/BW、LVW/HW與WT對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；KO模型組小鼠的HW/BW、LVW/HW低于WT模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 四組小鼠HW/BW、LVW/HW的比較Tab.2 Comparison of HW/BW and LVW/HW among four groups of mice ±s

表2 四組小鼠HW/BW、LVW/HW的比較Tab.2 Comparison of HW/BW and LVW/HW among four groups of mice ±s

注：與WT對(duì)照組比較，*P＜0.05；與WT模型組比較，#P＜0.05

例數(shù)8 8 8 8組別WT對(duì)照組WT模型組KO對(duì)照組KO模型組F值P值HW/BW 0.231±0.031 0.377±0.042*0.228±0.034 0.293±0.031#9.392＜0.001 LVW/HW 0.193±0.022 0.284±0.032*0.201±0.025 0.237±0.029#15.283＜0.001

2.5 四組小鼠心肌病理改變的HE染色檢測(cè)WT模型組與KO模型組小鼠心肌組織中細(xì)胞排列規(guī)則、間質(zhì)未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；WT模型組小鼠心肌組織中細(xì)胞排列混亂，有水腫現(xiàn)象，肌纖維明顯增粗；KO模型組小鼠心肌的病理改變較WT模型組小鼠明顯改善。見(jiàn)圖4。

2.6 四組小鼠血清中炎癥因子含量的Elisa檢測(cè)及心肌中炎癥因子表達(dá)水平的PCR檢測(cè)四組小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較如下：WT模型組小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)水平均高于WT對(duì)照組（P＜0.05）；KO對(duì)照組小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)水平與WT對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；KO模型組小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)水平均低于WT模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 四組小鼠血清中炎癥因子含量及心肌中炎癥因子表達(dá)水平的比較Tab.3 Comparison of the content of inflammatory factors in serum and the expression level of inflammatory factors in myocardium among four groups of mice ±s

表3 四組小鼠血清中炎癥因子含量及心肌中炎癥因子表達(dá)水平的比較Tab.3 Comparison of the content of inflammatory factors in serum and the expression level of inflammatory factors in myocardium among four groups of mice ±s

注：與WT對(duì)照組比較，*P＜0.05；與WT模型組比較，#P＜0.05

組別WT對(duì)照組WT模型組KO對(duì)照組KO模型組F值P值例數(shù)8 8 8 8血清炎癥因子水平（ng/mL）IL-1β 3.12±0.66 7.58±0.94*3.04±0.57 4.74±0.61#15.832＜0.001 IFN-γ 1.84±0.32 3.94±0.52*1.77±0.26 2.44±0.29#12.774＜0.001 TNF-α 5.41±0.84 9.19±1.21*5.72±0.94 7.74±1.09#11.928＜0.001心肌炎癥因子mRNA表達(dá)IL-1β 1.00±0.12 1.88±0.25*1.09±0.14 1.40±0.20#10.284＜0.001 IFN-γ 1.00±0.15 2.31±0.32*0.96±0.15 1.62±0.22#18.832＜0.001 TNF-α 1.00±0.19 2.03±0.26*1.04±0.17 1.49±0.19#12.382＜0.001

2.7 四組小鼠心肌中STAT3活化的免疫印跡檢測(cè)四組小鼠心肌中p-STAT3表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較如下：WT模型組小鼠心肌中p-STAT3的表達(dá)水平高于WT對(duì)照組（P＜0.05）；KO對(duì)照組小鼠心肌中p-STAT3的表達(dá)水平與WT對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；KO模型組小鼠心肌中p-STAT3的表達(dá)水平低于WT模型組（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討論

CHF的臨床診療缺少針對(duì)病理生理機(jī)制的治療手段，主要與疾病的發(fā)病機(jī)制未明相關(guān)，雖然心肌重構(gòu)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原代謝異常等與CHF病情進(jìn)展的關(guān)系受到一致認(rèn)可[9-10]，但相關(guān)的調(diào)控機(jī)制仍未明確，因而也缺乏能夠預(yù)防或延緩CHF病理進(jìn)程的治療靶點(diǎn)。

近些年，慢性炎癥反應(yīng)在多種心血管疾病中的作用受到廣泛關(guān)注，炎癥反應(yīng)激活不僅直接促進(jìn)心肌中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、導(dǎo)致心肌損傷及間質(zhì)纖維化，還參與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、膠原代謝等過(guò)程的調(diào)控，進(jìn)而加重心肌損傷及間質(zhì)纖維化[11-13]。CHF相關(guān)的臨床研究證實(shí)血清中炎癥因子IL-8、TNF-α、IFN-γ等增多與患者心功能減退、預(yù)后不良有關(guān)[14-16]；相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)多種改善心功能的藥物能夠在CHF模型中減輕心肌炎癥反應(yīng)，抑制心肌中IL-8、TNF-α、IFN-γ等炎癥細(xì)胞因子的釋放[17-18]。在眾多與CHF發(fā)病相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子中，IL-8的表達(dá)廣泛、生物學(xué)作用多樣，本研究在腹主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的CHF模型小鼠中觀察到心肌IL-8的表達(dá)水平明顯增加，在此基礎(chǔ)上將深入研究IL-8高表達(dá)在CHF發(fā)病中的作用及機(jī)制。

CHF模型小鼠的心肌中IL-8呈高表達(dá)趨勢(shì)，為了研究IL-8的生物學(xué)作用，本研究通過(guò)LoxP-Cre系統(tǒng)進(jìn)行了心肌中IL-8的特異性敲除，在特異性敲除心肌中IL-8的表達(dá)后進(jìn)行CHF造模并通過(guò)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)、NT-proBNP檢測(cè)觀察心功能的情況。單純進(jìn)行心肌中IL-8的敲除后，小鼠的心功能正常，表明在生理?xiàng)l件下IL-8表達(dá)缺失并不直接影響心功能；在特異性敲除心肌IL-8并造模后，小鼠的各項(xiàng)心功能指標(biāo)與野生型CHF模型小鼠比較明顯改善，表明心肌特異性IL-8敲除能夠改善CHF小鼠的心功能，進(jìn)而提示CHF小鼠心肌中IL-8表達(dá)增加與心功能的減退有關(guān)。

IL-8是具有廣泛生物學(xué)作用的細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)、組織纖維化、細(xì)胞存活和凋亡等調(diào)控，抑制IL-8能夠在心肌缺血再灌注過(guò)程中起到抗炎、抗凋亡、抑制纖維化等保護(hù)作用。在CHF的發(fā)病過(guò)程中，心肌中高表達(dá)的IL-8也可能發(fā)揮調(diào)控炎癥反應(yīng)、組織纖維化的生物學(xué)功能，進(jìn)而導(dǎo)致心肌重構(gòu)及心功能減退[19-21]。本研究在特異性敲除心肌IL-8并造模后觀察到心肌組織中CHF相關(guān)的病理改變較野生型CHF小鼠減輕，同時(shí)心肌中炎癥因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)較野生型CHF小鼠降低，表明心肌特異性IL-8敲除能夠減輕CHF小鼠的心肌病理改變及炎癥反應(yīng)，這為IL-8在CHF發(fā)病過(guò)程中調(diào)控心肌病理改變提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究還將通過(guò)心肌特異性IL-8敲除實(shí)驗(yàn)初步探索IL-8參與CHF發(fā)病的相關(guān)分子機(jī)制。IL-6、IL-8、IL-35等白介素的生物學(xué)作用與下游STAT3通路密切相關(guān)，在細(xì)胞因子的持續(xù)作用下細(xì)胞內(nèi)的STAT3會(huì)磷酸化為p-STAT3，后者具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，能夠通過(guò)NF-κB增加多種炎癥因子的表達(dá)、促進(jìn)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大[5，22]。在CHF的發(fā)病過(guò)程中，STAT3呈過(guò)度活化的趨勢(shì)；多種具有改善心功能的藥物能夠抑制STAT3的磷酸化并發(fā)揮治療作用。本研究在特異性敲除心肌IL-8并造模后觀察到心肌組織中p-STAT3的表達(dá)水平與野生型CHF模型小鼠比較明顯降低，表明心肌特異性IL-8敲除對(duì)STAT3的磷酸化活化具有抑制作用，進(jìn)而提示IL-8可能通過(guò)STAT3在CHF的發(fā)病中發(fā)揮生物學(xué)作用。

綜上所述，CHF發(fā)病過(guò)程中心肌IL-8表達(dá)明顯增加；心肌特異性IL-8敲除顯著改善CHF小鼠的心功能及心肌炎癥反應(yīng)，IL-8敲除的上述改善作用可能與抑制STAT3磷酸化活化有關(guān)。未來(lái)，IL-8/STAT3途徑有望成為研究CHF發(fā)病機(jī)制的新靶點(diǎn)，以IL-8為靶點(diǎn)、也可作為靶向防治CHF的新方向。