王 計(jì)，吳小微，晏 妮

胃癌是具有高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤之一，隨著對(duì)胃癌發(fā)病分子機(jī)制的深入研究，分子靶向治療在胃癌治療中顯示出良好的效果[1-2]。環(huán)狀RNA(circRNA)在胃癌的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，可作為其新型潛在診斷生物標(biāo)志物[3]。研究報(bào)道大腸癌病人血漿中circ_0001178上調(diào)，且與病人的臨床病理結(jié)果相關(guān)[4]。高circ_0001178的大腸癌病人更容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性臨床特征、晚期TNM分期和不良預(yù)后；敲低circ_0001178削弱了大腸癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力[5]。circ_0001178在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，敲減circ_0001178通過調(diào)節(jié)miR-382/VEGFA軸抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[6]。然而circ_0001178對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制尚不清楚。研究[7]發(fā)現(xiàn)miR-1179在胃癌組織和細(xì)胞系中均顯著下調(diào)，miR-1179表達(dá)的降低與胃癌病人的腫瘤大小增加、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)；過表達(dá)miR-1179通過靶向HMGB1抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[7]。此外，miR-1179的過表達(dá)顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[8]。circFOXM1通過使miR-1179海綿化并調(diào)節(jié)HMGB1表達(dá)調(diào)控乳頭狀甲狀腺癌的進(jìn)展[9]。而circ_0001178是否通過靶向調(diào)控miR-1179影響胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡目前還尚未可知。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究circ_0001178對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制是否與miR-1179有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2017年6月至2020年6月我院病理科存檔且已確診胃癌的33例病人胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本，其中男12例，女21例，年齡34～76歲。所有病人術(shù)前未進(jìn)行放化療，均知情且同意。

1.2 主要試劑 胃癌細(xì)胞株AGS購自美國ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購自杭州鷹旸生物科技有限公司；Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；MTT試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國Sciencell公司；RIPA蛋白裂解液購自上海貝博-Bestbio生物公司；cleaved-caspase3和cleaved-caspase9抗體購自美國CST公司；GAPDH抗體和二抗(山羊抗兔IgG-HRP)購自美國Abbiotec公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國GeneCopoeia公司。

1.3 細(xì)胞處理與分組 胃癌細(xì)胞株AGS常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將si-NC、si-circ_0001178、miR-NC、miR-1179分別轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞，記為si-NC組、si-circ_0001178組、miR-NC組、miR-1179組；將si-circ_0001178分別與anti-miR-NC、anti-miR-1179共轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞，記為si-circ_0001178+anti-miR-NC組、si-circ_0001178+anti-miR-1179組。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，不予轉(zhuǎn)染。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)circ_0001178和miR-1179的表達(dá)水平 提取胃癌組織、癌旁組織和各組細(xì)胞的總RNA，合成cDNA后按試劑盒說明進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。以GAPDH和U6為內(nèi)參，circ_0001178上游引物序列：5′-ACC CAG ATA CTA CAG CAA GCC-3′，下游引物序列：5′-TTG GCT TCC CAC ACT GAT GT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGT TGC CAT CAA TCA CCC CTT-3′，下游引物序列：5′-CTC CAC GAC GTA CTC AGC G-3′；miR-1179上游引物序列：5′-GCG GAA GCA TTC TTT CAT-3′，下游引物序列：5′-CAA GGG CTC GAC TCC TGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGC TTC GGC AGC ACA TAT ACT A-3′，下游引物序列：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC A-3′。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成數(shù) 將si-NC組、si-circ_0001178組、miR-NC組、miR-1179組、si-circ_0001178+anti-miR-NC組、si-circ_0001178+anti-miR-1179組細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，然后以每孔100個(gè)接種于6孔板中，約培養(yǎng)2周，用PBS清洗，然后用甲醇固定，再用吉姆薩染色30 min，低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明操作，先加入20 μL的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，再加入二甲基亞砜溶液，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，漂洗細(xì)胞后按試劑盒說明分別加入Annexin V-FITC和PI溶液，混勻，避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉，分別加入cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 生物學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)顯示circ_0001178的序列中含有與miR-1179互補(bǔ)的核苷酸序列；構(gòu)建circ_0001178野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶載體。取對(duì)數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的AGS細(xì)胞，隨機(jī)分為miR-NC組、miR-1179組，分別與miR-NC和miR-1179共轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞中，按照說明書檢測(cè)熒光素酶活性。將AGS細(xì)胞隨機(jī)分為pcDNA組、pcDNA-circ_0001178組、si-NC組、si-circ_0001178組、分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circ_0001178、si-NC、si-circ_0001178至AGS細(xì)胞，按1.4中方法檢驗(yàn)miR-1179表達(dá)水平。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，不予轉(zhuǎn)染。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 circ_0001178和miR-1179在胃癌組織中表達(dá) 胃癌組織中circ_0001178表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.01)，而miR-1179表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(P<0.01)(見表1)。

表1circ_0001178和miR-1179在胃癌組織中的表達(dá)

2.2 抑制circ_0001178表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響 與si-NC組比較，si-circ_0001178組circ_0001178表達(dá)水平降低(P<0.01)，AGS細(xì)胞克隆形成數(shù)減少(P<0.01)，細(xì)胞活性降低(P<0.01)(見表2)。

表2 抑制circ_0001178表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響

2.3 抑制circ_0001178表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC組比較，si-circ_0001178組AGS細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)水平升高(P<0.01)(見表3)。

表3 抑制circ_0001178表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響

2.4 circ_0001178靶向調(diào)控miR-1179的表達(dá) 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT-circ_0001178與miR-1179共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性低于WT-circ_0001178與miR-NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(P<0.01)；而MUT-circ_0001178與miR-1179或miR-NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。過表達(dá)circ_0001178后miR-1179表達(dá)水平降低，而抑制circ_0001178表達(dá)后miR-1179表達(dá)水平升高(P<0.05)(見表5)。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5circ_0001178調(diào)控miR-1179的表達(dá)

2.5 miR-1179過表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-1179組miR-1179表達(dá)水平升高(P<0.01)，AGS細(xì)胞克隆形成數(shù)減少(P<0.01)，細(xì)胞活性降低(P<0.01)，AGS細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)水平升高(P<0.01)(見表6)。

2.6 干擾miR-1179表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0001178表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的作用 與si-circ_0001178+anti-miR-NC組比較，si-circ_0001178+anti-miR-1179組miR-1179表達(dá)水平降低(P<0.01)，AGS細(xì)胞的克隆形成數(shù)增加且活性升高(P<0.01)，而凋亡率降低(P<0.01)，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)水平降低(P<0.01)(見表7)。

表7 干擾miR-1179表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0001178表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的作用

3 討論

胃癌是我國高發(fā)腫瘤，晚期胃癌以藥物治療為主，然而方法有限，療效亟待提高；近年來，分子靶向藥物的出現(xiàn)給晚期胃癌病人的治療帶來新的方向[10-11]。因此，尋找新的特異性靶點(diǎn)以研發(fā)分子靶向藥物對(duì)胃癌的治療具有重要意義。研究[12]發(fā)現(xiàn)，多種circRNA參與胃癌的進(jìn)展過程，下調(diào)的circRNA_001569降低胃癌細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。下調(diào)circ-ARHGAP26抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。然而circ_0001178對(duì)胃癌的影響尚未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌組織中circ_0001178表達(dá)水平升高，提示circ_0001178可能在胃癌中起促癌基因作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步抑制circ_0001178表達(dá)后，AGS細(xì)胞克隆形成數(shù)減少，細(xì)胞活性降低，AGS細(xì)胞凋亡率升高，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)水平升高；表明抑制circ_0001178表達(dá)可抑制胃癌AGS細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

表6miR-1179過表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

研究[14]報(bào)道m(xù)iR-1179通過靶向E2F5抑制人胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-1179通過靶向精子相關(guān)抗原5(SPAG5)/Akt軸抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長和侵襲[15]。且已有文獻(xiàn)[7]報(bào)道m(xù)iR-1179可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-1179表達(dá)水平降低，過表達(dá)miR-1179可見降低克隆形成數(shù)及細(xì)胞活性，提高細(xì)胞凋亡率；表明過表達(dá)miR-1179不僅可抑制胃癌細(xì)胞增殖，還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究[16]報(bào)道circ_0084927通過調(diào)控miR-1179/CDK2促進(jìn)宮頸癌發(fā)生；circ_0039411通過miR-1179/ABCA9和miR-1205/MTA1信號(hào)通路促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生和發(fā)展[17]。說明circRNA可通過調(diào)控miR-1179 參與腫瘤進(jìn)展過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，circ_0001178靶向負(fù)調(diào)控miR-1179；干擾miR-1179表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0001178表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的作用。

綜上所述，抑制circ_0001178表達(dá)可能通過靶向上調(diào)miR-1179抑制胃癌AGS細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。