陳偉明，周麗華，徐武華

1廣州市紅十字會醫(yī)院康復醫(yī)學科（神內(nèi)二區(qū)），廣東 廣州 510220；2廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510510

隨著Aβ疫苗研究的紛紛失敗，阿爾茨海默?。ˋD）的病因和發(fā)病機制變得更加撲朔迷離［1］，但免疫療法依然保留在最有潛力的AD防治選項之中［2-4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)生的抗β淀粉樣蛋白抗體（nAb-Aβ）高頻率、無差別地出現(xiàn)在AD患者和正常人群的外周血中［5］，且可能先于腦內(nèi)Aβ斑塊的形成，并在自然衰老過程中呈現(xiàn)出"U"型的年齡相關(guān)性變化［6］。另一方面，既往研究采用雙抗原夾心的ELISA方法也先后證實nAb-tau存在于AD患者、其他類型癡呆患者及正常人外周血及腦脊液（CSF）中［7-8］，但因樣本量較小且均未針對該抗體的免疫特性進行更深入的研究并未引起足夠的重視，其臨床價值也迄今未明。本研究將分別采用Western blot和IHC兩種方法分別論證nAb-tau在AD型癡呆、其他類型癡呆患者以及不同年齡段認知正常者外周血和CSF中的發(fā)生率以及免疫特性，以期從腦內(nèi)tau免疫應答的角度洞悉AD的病理機制，并探討其作為AD生物學診斷標志物的科學性和可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2006～2018年于廣州市紅十字會醫(yī)院康復醫(yī)學科住院的95名癡呆患者及93名NC受試者中，選取5例AD患者、5例OD患者和10例NC受試者。同時獲得血漿和CSF標本，并進一步行Western blot檢測，20例NC組患者血漿進行IHC，其中OD組包括3例血管性癡呆、1例額顳葉癡呆及1例帕金森病癡呆。AD組納入標準：AD診斷符合美國國立神經(jīng)病學與語言障礙、卒中和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會規(guī)定［9］；OD組納入標準：符合美國國立神經(jīng)疾病與腦卒中研究所制定的診斷標準，血管性癡呆、額顳葉癡呆及帕金森病癡呆分別符合其相應診斷標準［9-11］；NC組納入標準：體格查體和神經(jīng)心理學檢查均排除癡呆的診斷。排除標準：患有嚴重的肝腎功能損傷、急性心肌梗死、惡性腫瘤及其他危及生命的疾病者。本研究得到廣州市紅十字會醫(yī)院倫理委員會批準同意，所有的研究對象入組前均得到充分告知并簽署了知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 收集部分患者在凍存的入院48 h內(nèi)行腰椎穿刺術(shù)留取CSF 2.5 mL，4 ℃，3000 r/min 離心20 min，分離上清，置于-80℃冰箱保存，待測。收集患者在凍存的入院48 h內(nèi)全血5.0 mL，4 ℃，3000 r/min離心20 min，分離上清制備成血漿，置于-80℃冰箱保存，待測。

1.2.2 Western blot法檢測血漿和CSF中的nAb-tau 將人工合成的全氨基酸序列的Tau441 蛋白（Abcam，0.2 μg/L）配置成20 μL定量上樣量加入SDS-PAGE凝膠，140V電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，2%牛奶液（BIO-RAD）封閉非特異性結(jié)合后，分別置于AT-8（ThermoFisher Sci.，1∶1000）、CSF（1∶5000）、血漿（1∶1000）稀釋液和PBS中，4 ℃孵育過夜。洗膜后，滴加辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（碧云天，1∶2000），室溫孵育1 h，光化學顯色法檢測免疫反應帶，采用Image lab6.0軟件測量灰度值。

1.2.3 IHC檢測nAb-tau的組織免疫學特性（1）Tg2576小鼠（雄性，體質(zhì)量20～25 g，SPF級）腦組織切片制備：Tg2576小鼠處死后取一側(cè)大腦半球制備成石蠟標本，切成5 μm厚的連續(xù)切片，4 ℃保存?zhèn)溆?；?）5 μm厚的Tg2576小鼠腦組織連續(xù)石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，微波修復抗原。分別采用AT-8（ThermoFisher Sci.，1∶400）、血漿（1∶100）、CSF（1∶100）和PBS 作為一抗，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（碧云天，1∶50）作為二抗，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，顯微鏡下肉眼判斷染色結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

1.3.1 樣本量估計 本研究欲探討血漿和/或CSF 中nAb-tau與AD發(fā)病的相關(guān)性，采取分層抽樣的方法，根據(jù)以往資料發(fā)現(xiàn)AD患者血漿/CSF中nAb-tau的檢出率約為95%［7-8］，以95%的可信度，要求結(jié)果落實在總體真實率的10%以內(nèi)，根據(jù)公式：N=Z1-α/22(1-p)/ε2p估算樣本量。該研究中，p=0.95，ε=0.1，α=0.05，則Z1-α/22=1.96，計算結(jié)果如下：N=1.962×(1-0.95)/0.12×0.95=20.21，因此共需20例，在實際研究中心最初共納入20名研究對象。

1.3.2 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計，各組計量資料均以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用n(%)表示采用χ2檢驗（樣本量≥40且理論頻數(shù)≥5）或校正χ2檢驗（樣本量≥40且1≤理論頻數(shù)＜5）或Fisher確切概率法（樣本量＜40）；定量數(shù)據(jù)的多組間比較采用單因素方差分析方法，隨后兩組間差異的比較采用SNK-q和LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測血漿或CSF中nAb-tau蛋白表達

2.1.1 受試者臨床資料的比較 3 組患者的性別、年齡、病程、CSF蛋白、CSF葡萄糖的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；MMSE 平均得分AD、OD 組較NC 組降低（P＜0.001），而AD組與OD組MMSE評分的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.938），AD、OD組受試者顱腦MRI可見腦萎縮，NC組患者則不明顯。3組臨床特征（表1）及頭顱MRI結(jié)果圖示（圖1）。

圖1 3組患者頭顱MRI結(jié)果Fig.1 MRI results of three groups.

表1 3組患者的臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data of three groups(Mean±SD)

2.1.2 Western blot檢測結(jié)果及其與MMSE分值的相關(guān)性 20份CSF標本及血漿標本分別來自AD、OD和NC組，其中19份（95%）CSF標本、2份（10%）血漿標本檢出與AT-8相似的免疫陽性帶（圖2）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，3組CSF中nAb-tau檢出率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.158，P=0.206，表2）。另外，2例陽性血漿均出現(xiàn)在NC組（2/10，20%），3組血漿中nAb-tau檢出率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.222，P=0.329，表3），nAb-tau檢出率在CSF中較血漿增高（P＜0.001），血漿和CSF的nAb-tau檢出率與MMSE均分的差異無統(tǒng)計學意義（表4）。

表2 3組受試者CSFnAb-tau檢出率的比較Tab.2 Comparison of detection rate of nAb-tau in CSF of three groups(n)

表3 3組受試者血漿nAb-tau檢出率的比較Tab.3 Comparison of detection rate of nAb-tau in plasma of three groups(n)

表4 3組受試者血漿/CSFnAb-tau檢出率與MMSE均分相關(guān)性Tab.4 Correlation between the detection rate of nAb-tau in plasma/CSF and the average scores of MMSE in three groups

圖2 血漿和CSFnAb-tau蛋白Western blot條帶Fig.2 Western blot bands of nAb-tau protein in plasma and CSF.

3.2 IHC結(jié)果

為了解血漿nAb-tau在自然衰老過程中的發(fā)生規(guī)律，將20例0～80歲NC組患者血漿標本按～10歲一個年齡段分為7組（表5），鑒于61～70歲和71～80歲兩個年齡段組僅有3例，故將其合并為61～80歲組。結(jié)果共檢出11例（55%）陽性血漿，但各年齡組的陽性率的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=4.512，P=0.608）。

表5 不同年齡段NC組患者血漿免疫染色Tg2576小鼠腦組織切片的結(jié)果Tab.5 The results of plasma from different-aged normal controls immunostaining Tg2576 mice brain tissue sections[n(%)]

為進一步分析nAb-tau的免疫特性，分別隨機選取Western blot（+）的CSF和血漿各1例、Western blot（-）的CSF和血漿各1例，進行IHC。結(jié)果顯示W(wǎng)estern blot（+）的CSF/血漿標本顯示出與單克隆抗tau抗體AT-8相似的組織免疫特性，可清晰地識別Tg2576小鼠腦組織切片中的退變神經(jīng)軸索（圖3B、C），而Western blot（-）CSF/血漿則未見任何染色陽性的退變軸索。

圖3 血漿/CSF免疫染色Tg2576小鼠腦組織切片結(jié)果（IHC染色,×400）Fig.3 The results ofplasma/CSF immunostaining Tg2576 mice brain tissue sections(IHC staining,×400).

3 討論

在諸多AD病理機制假說中，異構(gòu)化的Aβ蛋白和tau蛋白可能是誘導腦內(nèi)免疫應答異常和慢性遷延性炎癥的源頭［12-13］。課題組業(yè)已證實了外周血nAb-Aβ可能早于腦內(nèi)Aβ斑塊的形成，進一步提示了這一針對異構(gòu)化生理蛋白的免疫應答過程并非僅發(fā)生在AD患者，也同樣出現(xiàn)在各年齡段的正常人［6］。本研究采用了與前期研究相似的方法對nAb-tau的免疫特性和臨床價值進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總陽性率（11/20，55%）略高于nAb-Aβ的35.6%［6］，且各年齡組陽性率的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=4.512，P=0.608）。免疫特性分析研究進一步證實，3 組CSF 中的nAb-tau 均可同時識別人工合成的tau441以及Tg2576小鼠腦組織切片中的退變神經(jīng)軸索。由此認為，nAb-tau很可能與nAb-Aβ［5-6］一樣高頻率、無差別地出現(xiàn)在人類的全生命周期，并具備相似的免疫特性。

既往臨床病理研究業(yè)已證實，神經(jīng)原纖維纏結(jié)和Aβ斑塊在AD大腦中存在著相似的跨腦區(qū)擴散的演變規(guī)律，但前者的臨床意義遠大于后者［14-15］。本研究和既往研究［7-8］均觀察到nAb-tau廣泛存在于AD及包括正常認知的非AD患者的CSF及外周血中，這一現(xiàn)象提示神經(jīng)元細胞內(nèi)的神經(jīng)骨骼蛋白誘導的免疫應答可能較早地參與了包括AD在內(nèi)諸多中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的病理過程，但同樣的疑問也同時出現(xiàn)在nAb-Aβ和nAbtau中，即這兩種自身免疫應答反應究竟是AD病理的始作俑者，抑或僅僅只是一種次病理現(xiàn)象；這兩種自身抗體的出現(xiàn)對AD的發(fā)生和發(fā)展是保護性的，還是破壞性的。有學者定量對比研究了帕金森病性癡呆和帕金森病非癡呆兩組患者的血清nAb-tau水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者明顯低于后者（P=0.007）［16］。本研究顯示，AD組及OD組血漿nAb-tau檢出率（0%）低于NC組（10%，P=0.329），但隨后的IHC研究也發(fā)現(xiàn)該抗體也存在55%正常認知人群中。有學者采用轉(zhuǎn)人類tau基因小鼠（P301S）進行的tau蛋白抗體被動免疫研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射單克隆抗tau抗體（HJ8.5）后模型小鼠血漿中的tau蛋白水平明顯升高并伴隨著腦內(nèi)tau病理的改善和可溶性tau水平的升高［17-18］。上述結(jié)果均提示內(nèi)源性和外源性抗tau抗體的出現(xiàn)對于AD病理的發(fā)生和發(fā)展可能具有潛在的保護作用，但其對AD的診斷價值和預測價值仍需要更多循證醫(yī)學研究加以證實。本研究進行Western blot分析時腦脊液和血漿的稀釋倍數(shù)分別為1∶5000和1∶1000，但前者的nAb-tau檢出率仍遠高于后者（P＜0.001），提示該抗體很可能是從腦內(nèi)溢漏到外周的［7,18］。

本研究中年齡最小的IHC陽性血漿出現(xiàn)在新生兒中，而2 例Western blot 陽性血漿也來自NC 組，類似的現(xiàn)象也見于nAb-Aβ研究［5-6］和其他的nAb-tau研究中［8,19］，上述現(xiàn)象強烈提示：構(gòu)成AD兩大病理特征的關(guān)鍵蛋白Aβ和tau抗原很可能從生命初期就開始暴露在腦內(nèi)的免疫應答之中。長期以來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)被視為相對封閉的免疫豁免區(qū)［20］，但越來越多的研究證據(jù)顯示血腦屏障的破壞早期參與了AD的發(fā)生和發(fā)展［21］，且腦內(nèi)的淋巴管系統(tǒng)也并非與外界完全隔絕［22］。上述發(fā)現(xiàn)也為深入理解為什么AD狀態(tài)下如此多的腦內(nèi)生理性蛋白質(zhì)（Aβ、tau、低分子量神經(jīng)絲蛋白等）被免疫系統(tǒng)識別并誘導產(chǎn)生自身抗體提供了理論依據(jù)［23-24］。

近年來，在探索AD生物學診斷標志物上取得了長足的進展，已發(fā)現(xiàn)至少3種具有明確診斷價值和數(shù)十種具有潛在診斷價值的生物學標志物［25］，但其特異性和敏感度均存在較大的爭議。另外，（分子）神經(jīng)影像學的日新月異，以及多模態(tài)MRI、正電子發(fā)射斷層掃描等技術(shù)的發(fā)展為AD的早期診斷和個體化治療提供了全新的手段［26］。但基于種種原因，現(xiàn)今AD的臨床診斷仍主要依賴最為傳統(tǒng)的排他性診斷原則［27］。本研究試圖通過Western blot和免疫病理兩種方法論證nAb-tau的免疫特性和發(fā)生規(guī)律，也回歸分析了其與MMSE分值之間關(guān)聯(lián)（P＞0.05），但均未發(fā)現(xiàn)其具備AD生物學診斷標志物的基本條件。而隨著絕大多數(shù)Aβ和tau疫苗研究的近乎停滯［2-4,28-29］，越來越多的學者更傾向于支持AD是一種病因復雜，發(fā)病機制多樣的異質(zhì)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，且病因和病理機制并不僅僅局限于腦內(nèi)［30-32］。

目前尚無研究深入探討nAb-tau出現(xiàn)的分子機制，但必須指出的是，在諸多業(yè)已證實存在的自身抗體中，尚未發(fā)現(xiàn)任何一種對AD臨床具有參考價值［5-8,19］。綜上，全面而深入研究腦內(nèi)免疫應答機制以及血腦屏障在AD發(fā)生和發(fā)展中的作用，將有助于進一步理解包括nAb-tau等自身抗體的確切成因，并為未來的AD免疫治療研究指明方向。