王騰飛，馮志強，孫雅雯，趙善江，郝海生，鄒惠影，杜衛(wèi)華，趙學明，朱化彬，龐云渭

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

優(yōu)質卵母細胞是成功受精和胚胎發(fā)育的重要基礎，卵母細胞成熟過程中的任何異常都可能導致減數(shù)分裂停滯和受精失敗。由于在減數(shù)分裂過程中卵母細胞缺乏轉錄活性，因此轉錄后和翻譯后水平的調節(jié)對卵母細胞成熟至關重要[1]。特別是蛋白質翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)在卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育過程中的多種細胞事件中起著關鍵作用，如DNA損傷應答、染色體凝聚和細胞骨架組裝等[2]。O-β-N-乙酰葡糖胺(O-linked beta-N-acetylglucosamine, O-GlcNAc)修飾是一種與營養(yǎng)和應激關系密切的PTM，它將單個的N-乙酰葡糖胺以β-構型的O-糖苷鍵連接到蛋白質絲氨酸或蘇氨酸(Ser/Thr)羥基上，是一種動態(tài)、可逆的修飾[3]。O-GlcNAc修飾中的糖基供體二磷酸尿嘧啶-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)是己糖胺生物合成途徑(hexosamine biosynthesis pathway, HBP)的終產(chǎn)物。O-GlcNAc的可逆修飾由O-GlcNAc轉移酶(O-GlcNAc transferase, OGT)和相應的糖苷酶(O-GlcNAcase, OGA)動態(tài)調控，前者負責將糖基供體UDP-GlcNAc中的GlcNAc基團添加到目標蛋白的Ser/Thr羥基上，而后者能特異移除O-GlcNAc修飾蛋白上的GlcNAc[4]。

O-GlcNAc修飾影響蛋白質空間構象、活性和定位，廣泛參與信號傳導、細胞代謝重塑、蛋白互作、免疫應答等生理過程[5]。特別是，O-GlcNAc修飾在調節(jié)卵母細胞減數(shù)分裂成熟、早期胚胎發(fā)育和維持胚胎干細胞多能性等方面發(fā)揮重要作用[6-8]。在牛和豬的IVM液中添加UDP-GlcNAc底物葡糖胺(glucosamine，GlcN)不會影響卵母細胞的核成熟，但卵母細胞受精后的囊胚發(fā)育率顯著降低[9]。在小鼠上，GlcN處理不僅會降低MII期卵母細胞比例，受精后胚胎的卵裂率和囊胚率也顯著減少[10-11]。采用OGA抑制劑破壞O-GlcNAc修飾的動態(tài)平衡后，卵母細胞的O-GlcNAc水平顯著上調，盡管卵母細胞仍能正常進行減數(shù)分裂，但多精受精率顯著增加，最終導致受精卵發(fā)育異常[8]。上述研究表明，維持胞內(nèi)O-GlcNAc修飾水平的平衡對卵母細胞發(fā)育至關重要。

由于O-GlcNAc修飾反映了細胞所處代謝環(huán)境，可作為一種營養(yǎng)傳感器，為臨床醫(yī)學上治療糖尿病、肥胖和衰老等導致的卵母細胞質量下降提供新的靶點。因此，本試驗從作為感受微環(huán)境營養(yǎng)狀態(tài)的O-GlcNAc修飾層面研究O-GlcNAc修飾變化對牛卵母細胞體外成熟(invitromaturation, IVM)和發(fā)育能力的影響，并進一步探究了O-GlcNAc修飾對OGT和OGA的反饋調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所采用的牛卵巢均取自于河北省廊坊市大廠屠宰場，公牛冷凍精液購自于山東奧克斯生物技術有限公司。

1.2 試劑及溶液配制

TCM199和胎牛血清購自Gibco公司；無特殊說明，其余試劑均購自Sigma公司。

各溶液配制：IVM液：TCM199、0.01 IU·mL-1FSH、0.01 IU·mL-1LH、1 μg·mL-1E2、10 μg·mL-1肝素鈉、50 ng·mL-1EGF、100 ng·mL-1IGF、10% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素；BO液：112 mmol·L-1NaCl、4.02 mmol·L-1KCl、2.25 mmol·L-1CaCl2·2H2O、0.52 mmol·L-1MgCl2·6H2O、0.83 mmol·L-1NaH2PO4、37 mmol·L-1NaHCO3、13.9 mmol·L-1葡萄糖、1.25 mmol·L-1丙酮酸鈉、3 mg·mL-1BSA；洗精液：40 mL BO液+135.32 mg咖啡因(10 mmol·L-1)；受精液：10 mL BO液+200 mg BSA+0.05 mL肝素鈉(20 μg·mL-1)+0.1 mL青霉素(100 U·mL-1)和鏈霉素(100 μg·mL-1)；胚胎體外培養(yǎng)液mCR1aa：109.5 mmol·L-1NaCl、3.1 mmol·L-1KCl、26.2 mmol·L-1NaHCO3、0.8 mmol·L-1MgCl2·6H2O、1.19 mmol·L-1KH2PO4、0.4 mmol·L-1丙酮酸鈉、1.5 mmol·L-1葡萄糖、5 mmol·L-1半乳糖酸鈣、0.5% 酚紅、2% EAA(50×)、1% Non-EAA(100×)、15 mg·mL-1谷氨酰胺。

1.3 卵母細胞采集和體外成熟

從屠宰場收集卵巢，放入28～30 ℃含100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的滅菌生理鹽水中，2 h內(nèi)運回實驗室。用提前預熱30 ℃左右的滅菌生理鹽水將卵巢洗滌2～3遍，使用真空蠕動泵抽取卵巢上直徑3～6 mm卵泡內(nèi)的卵泡液，在體式顯微鏡下?lián)斐雎亚?卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)，分級并計數(shù)。

將挑選出的COCs用洗卵液洗2遍，再用IVM液洗3遍，之后移入在培養(yǎng)箱中已經(jīng)平衡2 h以上且覆蓋礦物油的四孔板中(每孔750 μL IVM液，培養(yǎng)50枚COCs)，IVM液中分別添加OGT抑制劑BADGP和OGA抑制劑PUGNAc，未添加組為對照。于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)22～24 h。

1.4 體外受精和胚胎的體外培養(yǎng)

將1支0.25 mL的冷凍精液在38 ℃的水浴鍋中解凍后，先加到含有2 mL洗精液(提前預熱)的15 mL離心管底部，之后再加入4 mL洗精液，用移液槍輕輕吹打混勻，1 800 r·min-1離心8 min；棄上清，重新加入6 mL洗精液，用移液槍輕輕吹打混勻，1 800 r·min-1離心8 min；棄上清，用洗精液重新懸浮精子沉淀。用血細胞計數(shù)器計算精子密度，調整精子密度為2×106個·mL-1。用移液槍吸取50 μL處理好的精子懸液加入到含有卵母細胞的受精微滴中，在38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中精卵共孵育8～18 h。

將受精后的合子用0.1%的透明質酸酶脫除卵母細胞表面的卵丘細胞后，用含6 mg·mL-1BSA的mCR1aa液洗3遍，移入培養(yǎng)微滴中(每滴20～30枚)進行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，觀察并記錄受精卵的卵裂率。之后移入含10% FBS的mCR1aa液中(每100 μL中20～30枚)，每2 d進行半量換液，體外培養(yǎng)7～8 d后，觀察并記錄囊胚發(fā)育率。

卵裂率(%)=(卵裂數(shù)/卵母細胞總數(shù))×100；囊胚率(%)=(囊胚數(shù)/卵裂數(shù))×100。

1.5 免疫熒光染色

利用0.1%的透明質酸酶對體外成熟培養(yǎng)22 h后的COCs進行脫卵丘處理，然后利用終止液(TCM199 + 10% FBS)終止消化反應。用0.1%PVA/DPBS洗3遍后，移入4%多聚甲醛(PFA)+ 0.5%TritonX-100液中，37 ℃固定通透45 min；再用0.1%PVA/DPBS洗3遍后，將卵母細胞置于1%BSA溶液中4 ℃封閉過夜。用含有0.02%Triton X-100的1%BSA溶液稀釋一抗(O-GlcNAc，Abcam，1∶500；TXNIP，Abcam，1∶500；OGT，Abcam，1∶500；OGA，Abcam，1∶500)并4 ℃孵育過夜，再用含有0.02%Triton X-100的1%BSA溶液稀釋二抗(Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG)，并室溫避光孵育1 h；洗3遍后采用DAPI壓片，在激光共聚焦顯微鏡下(TCS SP8, Leica，德國)觀察染色情況并采集圖像。

1.6 熒光定量PCR檢測

采用NCBI設計引物序列，由華大基因公司合成引物序列(表1)。利用qRT-PCR試劑盒(Thermo Fisher Scientific)在CFX384TM實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國)中進行定量分析。反應體系(10 μL)：上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板1 μL，SYBR 5 μL，無RNA酶水3.6 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s；4 ℃ ∞。每個樣品重復3次，每組卵母細胞樣品為50枚。利用2ΔΔT法以GAPDH為內(nèi)參基因計算各目的基因mRNA的表達水平。

表1 RT-qPCR引物信息

1.7 蛋白質免疫印跡(Western blot)

收集各組卵母細胞樣品(每組50枚)，震蕩離心使其充分裂解。樣品在20 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清并與樣品緩沖液混合，100 ℃下煮沸變性。按照標準程序在4%～15%梯度SDS-PAGE凝膠上分離蛋白提取液，之后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%的脫脂奶粉稀釋1 h，阻斷印跡。然后，4 ℃條件下，在5%的脫脂奶粉稀釋的RL2中孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min。ECL試劑盒顯色，將膜置于化學發(fā)光儀(Tanon，中國上海)中進行曝光，拍照并保存。采用Image J軟件對Western blot蛋白條帶進行灰度值分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個試驗至少重復3次，試驗結果以“平均數(shù)±標準差”表示。采用SAS統(tǒng)計軟件進行One-Way-ANOVA分析，用Duncan′s檢驗判斷不同處理間的差異顯著性，P<0.05即認為差異顯著。

2 結 果

2.1 OGT、OGA及O-GlcNAc 蛋白在牛體外成熟卵母細胞中的分布

為了研究牛體外成熟卵母細胞中O-GlcNAc 修飾調節(jié)的亞細胞分布，首先使用OGT和OGA的特異性抗體分別對卵母細胞中OGT和O-GlcNAc蛋白及OGA和O-GlcNAc蛋白進行免疫熒光共定位。結果顯示，OGT和O-GlcNAc蛋白共定位于體外成熟卵母細胞的細胞質和細胞核中(圖1)，而OGA和O-GlcNAc蛋白共定位于體外成熟卵母細胞的細胞質中，且相對集中在卵母細胞的皮質區(qū)(圖2)。

紅色代表OGA蛋白；綠色代表O-GlcNAc蛋白；箭頭所指為皮質區(qū)

2.2 O-GlcNAc 修飾水平變化對牛卵母細胞體外成熟的影響

將622枚卵母細胞(重復4次)分別在添加4 mmol·L-1BADGP和100 μmol·L-1PUGNAc的IVM液中進行體外成熟，未添加組為對照組(control)，研究O-GlcNAc修飾水平變化對牛卵母細胞體外成熟的影響。如表2所示，與對照組相比(70.8%)相比，BADGP處理組(52.8%)和PUGNAc處理組(60.9%)均顯著降低了牛卵母細胞第一極體排出率(P<0.05)，但二者之間差異不顯著(P>0.05)。

表2 O-GlcNAc 修飾水平變化對牛卵母細胞體外成熟的影響

2.3 O-GlcNAc 修飾水平變化對牛卵母細胞體外發(fā)育能力的影響

將上述不同處理組體外成熟卵母細胞進行體外受精，研究O-GlcNAc修飾水平變化對牛卵母細胞體外發(fā)育能力的影響。如表3所示，BADGP處理組(61.0%)和PUGNAc處理組(62.0%)的卵裂率與對照組(68.9%)相比差異不顯著(P>0.05)。與對照組(21.5%)相比，BADGP處理組(9.6%)和PUGNAc處理組(10.0%)的囊胚率顯著降低(P<0.05)。

表3 O-GlcNAc 修飾水平變化對牛卵母細胞體外發(fā)育能力的影響

2.4 O-GlcNAc 修飾水平變化對牛體外成熟卵母細胞OGT和OGA表達的反饋調節(jié)

為了研究O-GlcNAc 修飾水平變化對牛體外成熟卵母細胞中OGT和OGA表達的反饋調節(jié)機制，利用熒光定量PCR和Western blot技術檢測了不同處理組卵母細胞內(nèi)O-GlcNAc修飾水平及OGT、OGA的mRNA和蛋白表達情況。結果顯示，與對照組相比，BADGP處理顯著抑制了OGT 的mRNA和蛋白表達(圖3B)，卵母細胞的O-GlcNAc修飾水平隨之顯著下調(圖3A)；OGA的mRNA和蛋白表達雖有所降低，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05；圖3C)。PUGNAc處理后，OGA 的mRNA和蛋白表達顯著低于對照組(P<0.05；圖3C)，卵母細胞的O-GlcNAc修飾水平顯著升高(P<0.05；圖3A)；OGT的mRNA表達顯著上調，而OGT蛋白表達顯著下調(圖3B)。進一步對HBP的關鍵限速酶GFAT的表達檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，BADGP處理組GFATmRNA的表達顯著上調，而PUGNAc處理組GFATmRNA的表達顯著下調(P<0.05；圖3D)。

A. O-GlcNAc修飾水平；B. OGT mRNA和蛋白表達；C. OGA mRNA和蛋白的表達；D. GFAT mRNA的表達

2.5 O-GlcNAc 修飾水平變化對牛卵母細胞TXNIP mRNA和蛋白表達的影響

為了進一步檢測O-GlcNAc修飾水平變化對卵母細胞糖代謝的影響，檢測了不同處理組卵母細胞中糖代謝關鍵調控因子TXNIP 的mRNA和蛋白表達。結果顯示，與對照組相比，BADGP處理后，卵母細胞TXNIP mRNA和蛋白的表達顯著上調(P<0.05)；而PUGNAc處理組卵母細胞的TXNIP mRNA和蛋白的表達雖有所升高，但與對照組相比無顯著差異(P>0.05；圖4)。

A. TXNIP mRNA的表達；B. TXNIP 蛋白的表達

3 討 論

哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂成熟和受精過程的代謝需求旺盛，因此，卵母細胞對發(fā)育微環(huán)境中營養(yǎng)成分的變化高度敏感。而O-GlcNAc修飾是哺乳動物細胞重要的PTM之一，參與調節(jié)許多重要的生命活動，可作為一種營養(yǎng)物質傳感器調節(jié)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在牛體外成熟卵母細胞中，OGT、OGA和O-GlcNAc蛋白存在不同的亞細胞定位，OGT和O-GlcNAc蛋白共定位于體外成熟卵母細胞的細胞質和細胞核中，而OGA和O-GlcNAc蛋白共定位于體外成熟卵母細胞的細胞質中，且相對集中在卵母細胞的皮質區(qū)，這與Zhou等[8]的研究結果部分一致。之前的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠、牛和人卵母細胞減數(shù)分裂進程中，OGT富集在減數(shù)分裂紡錘體上，而OGA在紡錘體的表達很低，主要富集在皮質區(qū)[6,8]。OGT和OGA不同的亞細胞定位反映了二者在卵母細胞減數(shù)分裂成熟中可能具有各自獨特的功能[13]。深入研究O-GlcNAc、OGT和OGA在減數(shù)分裂成熟過程中的精確功能將為揭示PTM對配子質量的影響提供新的思路。

O-GlcNAc修飾及其相關酶在生物體的正常發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。敲除OGT會導致斑馬魚胚胎生長受限、細胞活力受損[14]。而OGT或OGA缺失會對小鼠造成致命損傷[15-17]。事實上，OGT和OGA在哺乳動物細胞和組織中廣泛表達[18]。研究發(fā)現(xiàn)，破壞O-GlcNAc修飾平衡會延遲卵母細胞減數(shù)分裂成熟進程[19]，后續(xù)的報道也進一步證實了這一結論[20-21]。然而，在牛上的研究發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc修飾的改變不影響卵母細胞的減數(shù)分裂進程，但會影響精子頭解聚及導致多精受精，進而造成早期胚胎發(fā)育受損[8]。在本研究中，成熟培養(yǎng)液中添加OGT或OGA的抑制劑顯著降低了牛卵母細胞體外成熟率和受精后的囊胚發(fā)育率，與上述研究結果一致。這表明，維持胞內(nèi)O-GlcNAc修飾平衡對卵母細胞成熟及早期胚胎發(fā)育至關重要。

OGT和OGA是添加和移除O-GlcNAc修飾基團、維持O-GlcNAc修飾動態(tài)平衡的唯一一對酶，二者實現(xiàn)了細胞內(nèi)數(shù)千種O-GlcNAc修飾蛋白的精密調控[3,22-23]。一些研究發(fā)現(xiàn)，OGT和OGA的表達對胞內(nèi)O-GlcNAc修飾水平的變化頗為敏感[24-27]。利用OGA抑制劑來提高胞內(nèi)O-GlcNAc修飾水平會導致OGT蛋白表達減少，OGA蛋白表達增加[24-26]。而采用OGT抑制劑或GFAT抑制劑降低O-GlcNAc修飾水平時，胞內(nèi)OGT蛋白表達增多，OGA蛋白表達減少[26-27]。以上結果表明，機體通過反饋調節(jié)OGT和OGA的表達來應對O-GlcNAc修飾水平的波動，進而維持細胞O-GlcNAc修飾的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本研究檢測不同處理組OGT和OGA的表達水平，發(fā)現(xiàn)OGT抑制劑BADGP處理顯著降低了OGT 的表達，卵母細胞的O-GlcNAc修飾水平發(fā)生下調，OGA 的表達降低；在OGA抑制劑PUGNAc處理組中，卵母細胞OGA 的表達顯著下調，O-GlcNAc修飾水平升高，OGT的蛋白表達顯著減少。本研究以卵母細胞為對象，得到的結果與已有的文獻報道存在一定的差異，說明生殖細胞的反饋調節(jié)可能有別于體細胞。

HBP是葡萄糖代謝途徑之一，生物機體利用碳水化合物(葡萄糖)、氨基酸(谷氨酰胺)、脂質(乙酰輔酶A)和核苷酸(尿苷)等4種主要大分子經(jīng)HBP代謝最終生成UDP-GlcNAc，UDP-GlcNAc是O-GlcNAc修飾的糖基供體[28]。而GFAT是HBP的關鍵限速酶。研究發(fā)現(xiàn)，GFAT的表達和活性受UDP-GlcNAc的反饋抑制調節(jié)，在糖尿病和一系列癌癥類型中均發(fā)現(xiàn)GFAT的異常表達[29-31]。實際上，GFAT、OGT和OGA均參與O-GlcNAc修飾內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調控[32]。與野生型相比，敲除OGT的線蟲模型GFAT的mRNA水平顯著升高[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc修飾水平的變化與GFATmRNA表達呈負相關，抑制OGT顯著上調了GFATmRNA的表達，而抑制OGA顯著下調了GFATmRNA的表達。結果表明，HBP途徑對O-GlcNAc修飾水平的變化可能存在一種補償機制，機體通過調節(jié)GFAT表達應對GlcNAc修飾水平的波動，進而維持胞內(nèi)O-GlcNAc修飾內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而，O-GlcNAc修飾水平的變化對GFAT活性的影響及轉錄后的調控機制還有待進一步研究。

硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)是參與葡萄糖代謝的一個關鍵調控因子。本實驗室前期利用RNA干擾技術降低TXNIP表達后，發(fā)現(xiàn)卵母細胞的葡萄糖攝取能力增強，卵母細胞成熟得到改善[34]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，HBP的變化能夠調控TXNIP的表達[35-36]。Filhoulaud等[37]報道，高糖誘導下，胰島β細胞發(fā)生TXNIP的O-GlcNAc修飾，發(fā)生O-GlcNAc修飾的TXNIP通過促進炎性細胞因子IL-1β的分泌，調節(jié)炎性小體的激活。以上研究提示，O-GlcNAc修飾環(huán)境與TXNIP活性調節(jié)可能存在一定的關系。在本研究中，采用OGT或OGA抑制劑改變卵母細胞的O-GlcNAc修飾水平，發(fā)現(xiàn)TXNIP 的表達均上調，表明O-GlcNAc修飾的改變可能影響了卵母細胞的糖攝取和糖代謝。然而，O-GlcNAc修飾對卵母細胞TXNIP活性的分子調控機制還需深入探究。

4 結 論

維持胞內(nèi)O-GlcNAc修飾的平衡對卵母細胞成熟及早期胚胎發(fā)育至關重要。成熟培養(yǎng)液中添加OGT或OGA的抑制劑顯著降低了牛卵母細胞體外成熟率和受精后的囊胚發(fā)育率，卵母細胞通過反饋調節(jié)OGT、OGA和GFAT的表達，以及上調葡萄糖調控關鍵因子TXNIP的表達應對O-GlcNAc修飾水平的波動。研究結果對研究哺乳動物生殖細胞代謝異常和改善卵母細胞質量具有參考意義。