黃曉宇，楊巧麗，閆尊強，王鵬飛，石海仁，滾雙寶,3*

(1.甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070； 2.西藏自治區(qū)農牧科學院，拉薩 850000；3.甘肅省現代養(yǎng)豬工程技術研究中心，蘭州 730070)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens,C.perfringens)是一種革蘭陰性厭氧芽孢桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境、人和動物胃腸道微生物群[1-2]。產氣莢膜梭菌能夠引起一系列人類和動物腸道疾病(CAED)，例如氣體壞疽、食物中毒、壞死性小腸結腸炎、炎癥性疾病、仔豬腹瀉、綿羊腸毒血癥等[3-4]，逐漸成為引起人類和動物組織中毒性疾病和腸道疾病的主要原因。按其所產4種主要致命毒素(α、β、ε和ι)類型不同，產氣莢膜梭菌被分為5種類型(A～E)[5]。

C型產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringenstype C,C.perfringenstype C, Cp)是新生仔豬腹瀉的重要感染性病原體之一[6]，已成為仔豬高發(fā)病率和高死亡率的重要因素，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失[7]。C型產氣莢膜梭菌被認為是引起哺乳動物高致命性、暴發(fā)性壞死性腸炎、小腸結腸炎和全身性疾病的主要原因[8], 同時也是幼畜死亡的一個重要原因[9]。此外，人類因食用受污染的動物產品或直接接觸受感染的動物亦會感染該菌[9]。C型產氣莢膜梭菌產生的α和β毒素進入腸道，吸附在腸道黏膜上，經腸道屏障系統(tǒng)被吸收到機體血液循環(huán)中，進而影響其他器官，如大腦[4]。目前，一些動物模型已被用來研究產氣莢膜梭菌相關的腸道疾病[10-13], 如雞、兔和鼠。但是目前關于仔豬如何應答C型產氣莢膜梭菌感染導致的腹瀉疾病尚不清楚。

circRNA是一種新型的非編碼RNA，由不含50-30極性和poly(A)尾孔的共價閉環(huán)結構，經數千個基因的前體mRNA (pre-mRNA)反向剪接產生，在細胞中更穩(wěn)定[14-15]。諸多研究表明，circRNA不僅可以通過激活或抑制基因的轉錄參與調控其功能，還能通過靶向miRNA、轉錄和干擾pre-mRNA剪接在基因表達中發(fā)揮潛在的調節(jié)作用[16-17]。但是目前有關circRNA如何參與調控仔豬應答C型產氣莢膜梭菌感染導致的腹瀉疾病尚不清楚。在本研究中，首先構建一個C型產氣莢膜梭菌感染仔豬致腹瀉的動物模型，并通過RNA測序全面描述C型產氣莢膜梭菌感染仔豬的回腸組織中circRNAs特異性表達譜，篩選并鑒定出差異表達的circRNAs，構建與C型產氣莢膜梭菌性疾病密切相關的ceRNA互作網絡，本研究不僅能為進一步研究circRNA調控仔豬抵抗C型產氣莢膜菌性腹瀉提供基礎，還可為今后豬抗腹瀉新品系的培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)

將C型產氣莢膜梭菌菌株CVCC 2032(購自中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京)置于牛肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖晃培養(yǎng)16 h (青島海博生物)。采用平板菌落計數法測定C型產氣莢膜梭菌的菌落形成單位(CFU)。

1.2 動物試驗

選擇6頭7日齡長大二元仔豬，經酶聯(lián)免疫吸附ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)檢測血清中大腸桿菌、沙門菌和產氣莢膜梭菌均為陰性后作為試驗仔豬，在適當的氣候控制和完全隔離條件下單獨飼養(yǎng)，自由采食。隨機選取3頭仔豬經口灌服1 mL 1×109CFU·mL-1C型產氣莢膜梭菌培養(yǎng)液[18]，連續(xù)5 d，作為處理組(TI組)，剩余3頭仔豬灌服無菌培養(yǎng)液，作為對照組(CI組)。

接種后，每天監(jiān)測每只仔豬的健康狀況，包括行為、食欲、精神和毛發(fā)狀況。評估并記錄仔豬每天糞便黏稠度，按照腹瀉評分標準進行評定：0 =正常、固體糞便；1=輕微腹瀉，糞便柔軟疏松；2=中度腹瀉，質軟不成型糞便；3=嚴重腹瀉、水樣糞便[19]。試驗結束后，采用巴比妥酸鹽麻醉法人道屠宰6頭仔豬，無菌采集TI組和CI組仔豬的回腸組織樣品，用無菌PBS緩沖液(pH 7.4)沖洗干凈，液氮速凍并保存于-80 ℃超低溫冰箱，以備RNA提取。

1.3 總RNA提取和 circRNA測序

提取TI組和CI組樣品中總RNA，經1%瓊脂糖凝膠檢測后，利用Qubit?RNA Assay Kit測定RNA濃度。使用NanoPhotometer分光光度計(IMPLEN, CA, USA)和RNA Nano 6000檢測試劑盒(Agilent Technologies, CA, USA)分別評估總RNA的純度和完整性。

取TI組和CI組樣品RNA 5 μg，按照說明書去除樣品核糖體RNA (Epicentre RibozeroTMrRNA 去除試劑盒，Epicentre, 美國)和線性RNA(RNase R，Epicentre, USA)。利用Next?UltraTMDirectional RNA Library Prep Kit制備circRNA測序文庫(NEB, 美國)，通過Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)進行質量評估后，在Illumina Hiseq 4000平臺(Illumina, San Diego, CA, USA)上進行測序，獲得150 bp配對端(PE150)序列。

1.4 數據比對

去除包含接頭序列、ploy-N和低質量(>50% of bases with Phred scores<5)的原始數據后，獲取clean數據，通過計算clean數據的Q20、Q30和GC含量，使用Bowtie2[20]將clean reads與豬參考基因組進行比對。

1.5 circRNA的鑒定和定量

使用clean reads中的find_circ[21]和CIRI2[22]檢測并識別circRNAs。首先使用TPM(Transcripts read count Per Kilobase Million)對潛在 circRNAs的原始計數進行標準化，以評估表達水平[23]。

1.6 circRNAs差異表達分析

基于負二項分布，使用DESeq2 R包[24]對circRNAs進行差異表達分析。采用Benjamini和Hochberg方法控制錯誤發(fā)生率，以P值<0.05的circRNAs視為差異表達。

1.7 GO和KEGG富集分析

利用DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov)分析和預測差異表達circRNA的線性轉錄本；利用GOseq R包[25]和 KOBAS 2軟件[26]對差異表達circRNA宿主基因進行Gene Ontology (GO)功能和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)信號通路富集分析。通過KOBAS軟件統(tǒng)計circRNA宿主基因的富集度[27]，校正P值<0.05為顯著富集。

1.8 circRNA-miRNA-gene互作網絡的預測

通過miRanda軟件預測差異表達circRNA外顯子中的microRNA靶點，構建circRNA/miRNA相互作用關系，用Cytoscape生成circRNA-miRNA-mRNA互作網絡圖[28]。

1.9 circRNA-miRNA-gene基因網絡與CAED分析

為研究circRNA相關的ceRNA網絡與CAED之間潛在調控關系，首先篩選TI組和CI組仔豬回腸組織中顯著差異表達circRNAs、miRNAs及其靶mRNAs的數據集(校正P<0.05)，同時確保circRNAs、miRNAs及其靶miRNAs的表達水平在一定的數量級；其次，circRNA相關的ceRNA網絡與CAED相關 (在Web of Science中搜索miRNA，在Genecards數據庫中搜索mRNA)；最后，進一步篩選參與炎癥、免疫或感染等相關信號通路的差異表達circRNAs。根據上述4個步驟篩選與CAED相關的ceRNA網絡。

1.10 qPCR驗證及數據分析

采用熒光定量qPCR檢測ceRNA網絡中6個circRNAs、3個miRNAs和4個mRNAs的表達水平，分別以GAPDH基因和U6基因作為內參基因，引物信息見表1。采用9.5 μL 2 × SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TaKaRa，中國大連)，正、反引物各1 μL，1 μL cDNA和7.5 μL游離RNase ddH2O的20 μL反應體系，在Roche熒光定量PCR儀進行檢測，溶解曲線用于評價PCR產物的特異性。

表1 circRNA、miRNA 和 mRNA熒光定量qPCR引物信息

1.11 數據統(tǒng)計分析

利用SPSS 21.0軟件進行試驗數據的統(tǒng)計學分析，采用獨立樣本T-test 分析和單因素方差分析(one-way ANOVA)檢測TI組和CI組仔豬糞便腹瀉評分；定量結果采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，所得數值均用“平均值±標準誤(X±SE)”表示，每個樣品設置3個生物學重復。

2 結 果

2.1 仔豬腹瀉評分及糞便中C型產氣莢膜梭菌數量

Cp感染導致仔豬出現了不同程度的腹瀉，對TI組和CI組仔豬的平均腹瀉評分和總腹瀉評分進行統(tǒng)計及差異顯著性分析。結果發(fā)現，TI組仔豬的平均腹瀉評分和總腹瀉評分分別為1.51±0.29和37.33±2.51，均極顯著高于CI組仔豬的平均腹瀉評分0.49±0.03和總腹瀉評分12.00±1.00(P<0.01，表2)。

表2 TI組和CI組仔豬腹瀉評分統(tǒng)計分析

2.2 Cp感染仔豬回腸circRNA的鑒定

經測序鑒定，C型產氣莢膜梭菌感染后，TI組和CI組仔豬回腸組織中共檢測到3 162個circRNAs(圖1A)，這些circRNAs的長度分布范圍為1～40 kb，大部分circRNA長度小于3 kb(圖1B)，其中最大長度為2 135 nt，最小長度為22 nt，平均長度為298 nt(圖1C)。大多數circRNA含有1～3個外顯子、內含子或基因間區(qū)域(圖1D)。在染色體分布方面，這些鑒定到的circRNAs主要來源于編碼蛋白質的基因外顯子區(qū)域(占81.39%)，部分來自基因間區(qū)域，少數來自內含子區(qū)域(圖1E)。

A. 仔豬染色體circRNAs的鑒定； B. 不同全長的circRNAs數量；C. 不同剪接長度的circRNAs數量；D. circRNAs外顯子區(qū)、基因間區(qū)和內含子區(qū)3種亞型特征；E. 仔豬回腸circRNAs分類

將Cp感染仔豬回腸組織 circRNA原始數據提交至NCBI Sequence Read Archive (SRA)數據庫，獲得登錄號PRJNA705036。

2.3 差異表達circRNA分析

對Cp感染的TI組和CI組鑒定到的3 162個circRNAs進行分析，發(fā)現2 854個circRNAs在兩組間共同表達，203個circRNAs和105個circRNAs僅在TI組和CI組中特異性表達(圖2A)。聚類結果顯示，TI組和CI組具有相同表達模式的circRNA聚類在一起(圖2B)。

以校正后P值 < 0.05為標準對鑒定到的circRNA進行差異表達分析, 從TI組和CI組共鑒定到694個circRNAs顯著差異表達, 其中上調表達404個circRNAs，下調表達 290個circRNAs(圖2C)。還對cirRNAs進行了環(huán)狀基因組分析(圖3)，TI組和CI組中差異表達cirRNAs主要分布在1、2、3、6、8、9、13、14、15和X染色體上，每條染色體上分布的差異表達cirRNAs數量和差異倍數差別明顯(圖3)。

A. 維恩圖；B. 聚集熱圖，行表示差異表達circRNAs，列表示不同樣本；C. 火山圖，紅點和藍點分別代表上調和下調的circRNAs

紅色代表上調circRNAs，綠色代表下調circRNAs

2.4 功能富集分析

circRNAs的功能與circRNA的親本基因的功能相關。對TI組與CI組間差異表達circRNAs的親本基因進行GO功能富集分析，發(fā)現差異表達circRNAs主要富集在135個GO功能(校正P<0.05)，其中包括52個極顯著富集的GO功能(校正P<0.01)，包括26個生物過程、25個細胞組分和1個分子功能，如細胞器組織、細胞代謝過程、細胞大分子代謝過程等(圖4A)。KEGG信號通路富集分析鑒定出197條顯著富集的信號通路，top20富集的KEGG通路包括細胞周期、TGF-beta信號通路、賴氨酸降解、Wnt信號通路、T細胞受體信號通路、MAPK信號通路等(圖4B)，表明差異表達circRNAs通過其親本基因參與了細胞、免疫和信號轉導過程，揭示了差異表達circRNA親本基因的潛在功能。

圖4 TI組和CI組之間差異表達circRNA 親本基因GO功能(A)和KEGG信號通路(B)富集分析

2.5 circRNA-miRNA-mRNA相互作用關系預測

通過circRNA轉錄組測序從Cp感染的仔豬回腸組織中鑒定出694個顯著差異表達circRNAs，結合課題組前期從Cp感染組和對照組仔豬回腸組織中鑒定出53個顯著表達miRNAs[29]和3 669個顯著表達mRNAs[30]，構建了circRNA-miRNA-mRNA交互網絡(包括349個circRNA、36個miRNAs和233個mRNAs)(圖5)，如circ0006008- ssc-let-7i- TARBP2，circ0002897- miR-24-3p- ITM2C，circ0003611- miR-365-5p- NFKBID， circ0009977- miR-7134-3p- IL17RC等。這些ceRNA網絡基因可能在仔豬應答Cp感染過程中發(fā)揮重要作用。

2.6 circRNA-miRNA-mRNA網絡與CAED關系分析

為進一步分析circRNA相關的ceRNA網絡與CAED之間可能存在的關系，篩選出由8 circRNAs-5 miRNAs-12 mRNAs組成的關系網絡，由圖6可知，novel-circ0004881能夠通過競爭性結合miR-17-3p調控S100A9基因和ERBB2基因，novel-circ0014949能夠競爭性結合miR-204調控FAM167基因的表達，novel-circ0008552能夠競爭性結合miR-500調控RENBP、C5AR1和FADS3基因的表達。

2.7 qPCR驗證

對ceRNA網絡中的6個circRNAs，3個miRNAs和4個mRNAs的表達量進行qPCR驗證，檢測結果表明：circ0004881、circ0008552和circ0014117表達水平極顯著上調(P<0.01)，circ0008686和circ0002381表達水平極顯著下調(P<0.01)，miR-500、miR-17-3p、miR-204及S100A9、RENBP基因表達水平均顯著上調(P<0.05)，但circ0001746、C5AR1和FADS3基因表達水平顯著下調(P<0.05)，這些基因的表達水平與測序結果均一致(圖7)。

數據以“平均值±SEM”表示；*. P<0.05; **. P<0.01

3 討 論

近十年，C型產氣莢膜梭菌被認為是引起仔豬急性高度傳染性腹瀉、腸道炎癥性疾病及壞死性腸炎的重要致病菌之一，嚴重威脅著世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[3]。目前有關C型產氣莢膜梭菌感染引起仔豬腹瀉的研究主要集中在發(fā)病機制和疾病診斷、病理檢測等方面，由于人們對豬抵抗C型產氣莢膜梭菌感染性腹瀉疾病的調控機制研究不足，使得該類疾病目前尚無有效的治療方法。circRNAs是一種新發(fā)現的特殊非編碼RNA，廣泛存在于各類細胞中，具有充當競爭性內源RNA(ceRNA)，競爭性結合miRNA，調控其親本基因的表達及轉錄等多種生物學功能[31]。circRNA相關的ceRNA網絡可能在許多免疫和炎性疾病過程中發(fā)揮關鍵作用[32-33]。研究報道腸道組織has-circ-001569的表達與miRNA-145水平呈負相關，與miRNA-145靶基因E2F5、BAG4和FMNL2水平呈正相關，has-circ-001569通過競爭性結合miRNA-145，調控其靶基因E2F5、BAG4和FMNL2基因表達，促進細胞增殖和侵襲[34]。然而，circRNA如何調控仔豬應答C型產氣莢膜梭菌感染引起的腹瀉疾病尚不清楚。

本研究報道了C型產氣莢膜梭菌感染的仔豬回腸circRNA的表達模式，經分析，在TI組和CI組中共鑒定到3 162個circRNAs，其中694個circRNAs顯著差異表達(P<0.05)，包括404個circRNAs上調表達，290個circRNAs下調表達。為了進一步了解差異表達 circRNA的功能，本研究進行了差異表達circRNA的功能富集分析。值得注意的是，差異表達的circRNAs主要富集在12個KEGG信號通路，如TGF-beta信號通路、T細胞受體和MAPK等免疫相關信號通路，這些通路被報道是與C型產氣莢膜梭菌感染性疾病密切相關的信號通路[29]，該結果說明，circRNA可通過免疫相關信號通路調控仔豬應答C型產氣莢膜梭菌感染引起的腹瀉疾病。

本課題組前期報道了C型產氣莢膜梭菌感染仔豬回腸miRNA和mRNA的動態(tài)變化[29-30]，結合該數據，在分析circRNA、miRNA和mRNA表達相關性的基礎上，本研究進一步構建了C型產氣莢膜感染仔豬回腸組織差異表達circRNA相關的ceRNA調控網絡，共形成了836條circRNA、miRNA和mRNA相關關系(圖5)。在此ceRNA調控網絡中，發(fā)現一些circRNA可以與miR-15b、miR-21和miR-17-3p等競爭性結合，miR-15b、let-7i、S100A9、IL7R、IL17RC、CD101和TARBP2等免疫相關分子均被報道與宿主免疫系統(tǒng)疾病密切相關。有研究報道，miR-15b、miR-17-3p、miR-29a和miR-21被認為與結直腸癌(CRC)和炎癥性腸炎(IBD)等疾病的發(fā)生發(fā)展有關，可作為疾病診斷及預后的生物標志物[35-36]。miR-15b與宿主空腸和回腸中某些細菌的拷貝數呈正相關，可作為免疫細胞發(fā)育的調節(jié)劑，對宿主腸道的發(fā)育具有潛在的調控功能[37]。因此推測，circRNA可能通過競爭性結合miRNA調控靶mRNA，在仔豬應答C型產氣莢膜梭菌感染性腹瀉過程中發(fā)揮免疫調節(jié)作用。

藍色正方形代表mRNA，紅色圓圈代表miRNA，黃色三角形代表circRNA

本研究篩選出了與CEAD相關的ceRNA調控網絡，包括8個circRNAs，5個miRNAs和12個mRNAs，如circ-0004881-miR-17-3p-S100A9、circ-0002381-miR-338-FMVK、circ-0014949-miR-204-FAM167等，其中circ-0008552-miR-500與RENBP、C5AR1和FADS3均具有潛在的靶向關系(圖6A)。qPCR檢測結果表明，Cp感染導致仔豬回腸miR-17-3p的表達顯著上調，其上游circ-0004881和下游靶基因S100A9的表達均顯著上調。miR-17-3p被circ-0004881競爭性吸附，抑制3種線粒體抗氧化酶:錳超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶2和硫氧還蛋白還原酶2，協(xié)同有效地去除細胞內的活性氧，提高腫瘤的治療效率[38]。鈣結合蛋白基因S100A9具有調控細胞增殖、誘導細胞凋亡、參與炎性應答、影響炎癥細胞的遷移、抵抗病原菌多種生物功能[39-40]。LPS通過抑制細胞活力、促進細胞凋亡和促炎癥因子的產生，誘導細胞發(fā)生炎癥損傷。Zhao等[41]利用脂多糖(LPS)感染小鼠，發(fā)現LPS處理的小鼠肺組織中S100A9基因的表達上調，說明S100A9基因的表達水平與LPS誘導的小鼠肺組織的炎癥反應密切相關。S100A9能顯著改善小鼠結腸組織的炎癥反應，減少免疫細胞(巨噬細胞、中性粒細胞)的浸潤和促炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6等)的產生[42]。本研究發(fā)現，Cp感染導致仔豬回腸S100A9基因顯著上調表達，說明circ-0004881可能通過競爭性結合miR-17-3p，影響S100A9基因的表達，參與仔豬抵抗Cp感染過程。

圖6 circRNA相關的ceRNA網絡與CAED之間的潛在關系

LPS刺激能夠激活巨噬細胞miR-500的表達上調，通過靶向MFN2抑制TGF-β/Smad的激活，促進細胞增殖和活化[43]。Wang等[29]研究發(fā)現，miR-500通過靶向調控ELK1、HSPA2、IL7R基因參與抵制Cp感染引起的仔豬疾病。上調表達的miR-500能通過抑制靶基因的表達，激活泛素偶聯(lián)受體相互作用蛋白1(RIP1)和NF-κB, 促進癌細胞的增殖和存活[44]。C5AR1是一種炎癥驅動因子，巨噬細胞能通過C5AR1的先天免疫反應，增加TNF-α炎癥反應，加劇機體炎癥因子的產生。補體在AOM/dss誘導的小鼠CRC模型的炎癥組織中被廣泛激活，導致多方面的后果。高表達的C5AR1可能通過調節(jié)某些關鍵細胞因子和趨化因子的產生，損傷CD8+T細胞，誘導腸道炎癥的發(fā)生，可能是腸道炎癥和腸癌發(fā)生的主控調控因子[45]。FADS3被認為是B細胞特異性基因，能夠特異性結合NK-κB、p63轉錄因子，參與機體的細胞增殖、氧化應激反應[46]。本研究中，circ-0008552和miR-500在Cp感染導致仔豬回腸組織中的表達顯著上調，C5AR1和FADS3基因的表達顯著下調，因此推測，circ-0008552可能競爭性結合miR-500，負調控C5AR1和FADS3基因的表達，參與Cp感染仔豬致腹瀉的過程。miR-204可以通過靶基因特異性抑制炎癥細胞的增殖、自噬并誘導細胞凋亡[47]，被認為是治療免疫、炎癥和癌癥相關疾病的潛在靶點。本課題組前期發(fā)現，miR-204在Cp感染腹瀉仔豬回腸組織和C型產氣莢膜梭菌CPB2毒素處理的腸上皮細胞IPEC-J2中均顯著高表達，此外過表達miR-204促進了豬IPEC-J2的凋亡和炎癥反應，抑制miR-204 則減弱了細胞的炎性反應[48]。本研究中，Cp感染導致仔豬回腸組織miR-204的表達水平顯著上調，可能促進了Cp感染導致的仔豬腸道炎癥及腹瀉癥狀。

4 結 論

本研究綜合分析了C型產氣莢膜梭菌感染的仔豬回腸組織 circRNA差異表達譜，篩選出694個差異表達circRNAs，主要富集在TGF-β、T細胞受體、MAPK等信號通路，構建出由8 circRNAs-5 miRNAs-12 mRNAs組成的ceRNA網絡與C型產氣莢膜菌感染致仔豬腹瀉相關，其中circ-0004881-miR-17-3p-S100A9可能在Cp感染引起的仔豬腹瀉過程中發(fā)揮潛在功能。