張瑞莉，張 迪，郭 榮，陳 陽，李廣興，黃小丹*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.黑龍江省實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

硒作為必需的微量元素，廣泛存在于動物組織中，硒能確保人體正常的生理機(jī)能，平衡人體的抗氧化狀態(tài)[1]，在維持人體正常的免疫系統(tǒng)中也起著非常重要的作用[2]。硒缺乏會導(dǎo)致脾、法氏囊等免疫器官發(fā)生損傷[3-4]。硒缺乏可通過線粒體介導(dǎo)的途徑引起心肌氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]，也可以通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡[6]。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，大量的研究表明，硒可以調(diào)控細(xì)胞凋亡[7-8]。Toll樣受體4(TLR4)作為toll樣受體家族成員，在體內(nèi)多種細(xì)胞中都有表達(dá)，如心肌細(xì)胞[9]、免疫細(xì)胞[10]等，被激活后可以觸發(fā)免疫炎性反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受感染挑戰(zhàn)，增強(qiáng)獲得性免疫應(yīng)答能力[11]。TLR2和TLR3主要在健康胸腺中表達(dá)[12]，而TLR4在胸腺炎和胸腺瘤中表達(dá)上調(diào)[13]。髓系二分化88(MyD88)和誘導(dǎo)IFN-β的主要含適配器蛋白(TRIF)是TLR4傳輸信號的兩個適配器[14]，MyD88通路能激活NF-κB，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生[15]，NF-κB也可以調(diào)控細(xì)胞凋亡[16]，激活促凋亡因子的產(chǎn)生。Gao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路來抑制炎癥和細(xì)胞凋亡。有研究表明，上調(diào)miR-140-5p可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路[18]，抑制KOA大鼠滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡，從而保護(hù)滑膜損傷。黃芪甲苷通過抑制TLR4/NF-κB信號通路保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡[19]。有研究表明，硒缺乏會導(dǎo)致胸腺組織發(fā)生損傷[20]，并且不同的外界因素都可能導(dǎo)致胸腺發(fā)生細(xì)胞凋亡[21-22]。但關(guān)于硒通過TLR4信號通路對胸腺細(xì)胞凋亡影響的研究較少，所以硒缺乏引起胸腺細(xì)胞凋亡過程中是否激活Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是人們感興趣的問題，因此本研究復(fù)制雞硒缺乏模型，觀察胸腺病理損傷情況，檢測胸腺組織中TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)。并在MSB1細(xì)胞中建立體外硒缺乏模型，通過干擾和過表達(dá)TLR4基因后，檢測MSB1細(xì)胞中TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)水平。旨在探討硒缺乏是否激活Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及如何參與雞胸腺細(xì)胞凋亡損傷，闡明缺硒性免疫器官損傷的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物和飲食

從中國哈爾濱益農(nóng)家禽有限公司購買了160只1日齡健康肉雞。將雞隨機(jī)分為缺硒組(L組)和對照組(C組)，每組80只。L組飼喂含硒0.004 mg·kg-1的自制低硒日糧，低硒日糧組成見表1，C組飼喂含硒0.2 mg·kg-1的全配方飼料(在硒缺乏日糧中添加Na2SeO3)。給肉雞提供一個適宜的環(huán)境，并有標(biāo)準(zhǔn)的光照控制(每天12 h)。每天進(jìn)行檢查，觀察雞的活動、運(yùn)動、生長、異常和壓力?；A(chǔ)日糧為在中國黑龍江省硒缺乏地區(qū)生產(chǎn)的玉米和豆粕。分別在第15、25、35、45、55天的不同時間點(diǎn)采集胸腺組織樣本。部分胸腺組織在4%甲醛溶液中固定，另一部分在-80 ℃下保存。

表1 低硒組日糧組成

1.2 組織病理學(xué)

胸腺組織樣品用10 mL·L-1福爾馬林溶液固定至少1周。采用常規(guī)方法制作病理石蠟切片(5 μm)，并用蘇木精和伊紅(H&E)染色。在光學(xué)顯微鏡(日本 Nikon)下觀察其病理變化。

1.3 透射電鏡檢查

固定胸腺組織經(jīng)脫水、飽和、包埋，切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色。在透射電子顯微鏡(H7650，日本東京)下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、處理和轉(zhuǎn)染

MSB1細(xì)胞在10% FBS(美國BioInd)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。MSB1細(xì)胞在含有50 mL·L-1CO237 ℃的溫箱中培養(yǎng)。將密度為2×106的MSB1細(xì)胞接種到24孔板中。將細(xì)胞隨機(jī)分為6組：正常MSB1細(xì)胞(C組)、缺硒MSB1細(xì)胞(L組)、siRNA陰性對照處理后缺硒培養(yǎng)的MSB1細(xì)胞(L+NCsiRNA)、siChTLR4處理后缺硒培養(yǎng)的MSB1細(xì)胞(L+siChTLR4)、pCMV-HA-N空質(zhì)粒處理后缺硒培養(yǎng)的MSB1細(xì)胞(L+pCMV-HA)，pCMV-HA-TLR4質(zhì)粒處理后缺硒培養(yǎng)的MSB1細(xì)胞(L+pCMV-HA-TLR4)。C組通常在含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。L組中的細(xì)胞在37 ℃下孵育4～6 h后變成含有1% FBS(BioInd，USA)，10 μg·mL-1胰島素(Solarbio，北京)和5 μg·mL-1轉(zhuǎn)鐵蛋白(Solarbio，北京)RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d被視為低硒條件。以Lipofiter(上海漢恒)為轉(zhuǎn)染試劑并嚴(yán)格按照說明書要求將空質(zhì)粒和TLR4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入L+pCMV-HA-N組和L+pCMV-HA-TLR4組的細(xì)胞中，其中，pCMV-HA-TLR4以pCMV-HA-N為載體、以HA為標(biāo)簽，融合了TLR4目的蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒(上海生工)。L+NCsiRNA組和L+siChTLR4組采用RNAFit(上海漢恒)作為轉(zhuǎn)染試劑，按照說明書將siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，ChTLR4基因siRNA序列上游引物：5′-GGAAGAGAUGUAAGUUUCAT-3′，下游引物：5′-UGAAACUUACAUCUCUUCCTT-3′，其他條件與L組相同。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

根據(jù)試劑盒說明書，使用雙AnnexinV/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒分析細(xì)胞凋亡。MSB1細(xì)胞1 000 r離心5 min，在室溫黑暗下，用AnnexinV-FITC和PI染色15 min。然后，用流式細(xì)胞術(shù)(FZCSARIA，中國)和FlowJo7.6.1軟件檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 AO/EB染色

采用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)檢測活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。MSB1細(xì)胞在24孔板上培養(yǎng)，用PBS洗滌，用AO/EB染色5 min。然后在熒光顯微鏡(日本 Nikon)下拍攝MSB1細(xì)胞。

1.7 總RNA的提取和qRT-PCR檢測

按照產(chǎn)品說明書，使用總RNA試劑盒II(天根生物技術(shù)有限公司，北京)從胸腺組織中提取總RNA。qRT-PCR在LightCycler@480系統(tǒng)(羅氏，瑞士)上進(jìn)行。引物序列詳見表2。采用2-ΔΔCt的方法計算靶基因的相對表達(dá)量，并與管家基因β-actin(用于mRNA)的表達(dá)量進(jìn)行比較。

表2 雞qPCR的基因序列

1.8 Western blot

用蛋白酶抑制劑和RIPA緩沖液提取胸腺組織和細(xì)胞總蛋白。等量的蛋白質(zhì)樣品用12% SDPS-PAGE分離，并電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)印后，用5%脫脂牛奶在37 ℃下封閉2 h。隨后，將硝酸纖維素膜在4 ℃的一抗中孵育過夜。用TTBS洗滌后，在室溫下，進(jìn)行二次抗體孵育2 h，然后用TTBS洗滌。該膜采用ECL超靈敏發(fā)光溶液進(jìn)行曝光。利用ImageJ軟件對波段強(qiáng)度進(jìn)行量化。本研究使用的抗體：ChTLR4 (1∶100)(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)病理解剖實(shí)驗(yàn)室制備的多克隆抗體)，MyD88 (1∶500，萬類，沈陽)，NF-κB (1∶500，萬類，沈陽)和Caspase-3 (1∶500，萬類，沈陽)，Caspase-9 (1∶500，萬類，沈陽)，Bax (1∶500，萬類，沈陽)， Bcl-2 (1∶500，萬類，沈陽)，GADPH (1∶1 000，Abmart，上海)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (1∶2000，ZSGB-B)。

1.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS (17版; SPSS，Chicago，IL，USA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)顯著性分析。用GraphPad (版本7.0，GraphPad Software inc.，San Diego，CA，USA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。在每種情況下至少進(jìn)行3個獨(dú)立的試驗(yàn)，并以“平均值(SEM)±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 硒缺乏雞胸腺形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 硒缺乏雞胸腺病理組織學(xué)觀察結(jié)果 雞胸腺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，C組雞胸腺皮質(zhì)髓質(zhì)界限清晰，淋巴細(xì)胞排列整齊。L組雞皮質(zhì)髓質(zhì)的淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞排列紊亂、皮質(zhì)髓質(zhì)充血、核碎裂，廣泛的局灶性壞死，隨著日齡的增加，缺硒組胸腺均出現(xiàn)損傷，并且在35日齡最為嚴(yán)重。

C.對照組；L.缺硒組；15～55. 15～55日齡的雞

2.1.2 硒缺乏雞胸腺組織透射電鏡觀察結(jié)果 電鏡結(jié)果顯示，C組雞胸腺組織淋巴細(xì)胞排列緊密，核質(zhì)比大、核膜光滑，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整(圖2a)。L組雞胸腺組織淋巴細(xì)胞間出現(xiàn)裂隙，體積縮小，細(xì)胞碎裂，核染色質(zhì)邊集，線粒體腫脹，嵴斷裂(圖2b)。

a. C組胸腺的超微結(jié)構(gòu)變化(比例尺:1 μm)；b. L組胸腺的超微結(jié)構(gòu)變化(比例尺:1 μm)；N. 細(xì)胞核；Mi. 線粒體

2.2 胸腺組織中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及凋亡相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達(dá)

2.2.1 硒缺乏雞胸腺組織中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與15日齡對照組相比，在L組胸腺中TLR4的mRNA相對表達(dá)在15日齡無明顯變化(P>0.05，圖3a)，在25～55日齡極顯著升高(P<0.01，圖3a)；MyD88和NF-κB的mRNA相對表達(dá)在15～55日齡極顯著升高(P<0.01，圖3b,c)。與15日齡對照組相比，L組胸腺中TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白相對表達(dá)在15～55日齡極顯著增加(P<0.01，圖3 d～g)。

a～c.胸腺組織中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA的表達(dá)水平；d.胸腺組織Western blot結(jié)果；e～g.胸腺組織中TLR4、MyD88和NF-κB的灰度值分析。與對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01。下同

2.2.2 硒缺乏雞胸腺組織中凋亡相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá) qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與15日齡C組相比，L組胸腺中Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA相對表達(dá)在15～55日齡均極顯著增加(P<0.01, 圖4a～c)，Bcl-2在第15～55日齡極顯著下降(P<0.01，圖4d)。與15日齡C組相比，L組胸腺中Caspase-3、Caspase-9和Bax的蛋白相對表達(dá)在15～55日齡極顯著增加(P<0.01,圖4f～h)；Bcl-2蛋白相對表達(dá)在15～55日齡極顯著降低(P<0.01，圖4i)。

a～d. 胸腺組織凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量；e.胸腺組織Western blot結(jié)果；f～i.胸腺組織中凋亡相關(guān)基因表達(dá)蛋白的灰度值分析

2.3 硒缺乏誘導(dǎo)MSB1細(xì)胞凋亡

AO/EB染色結(jié)果(圖5a)顯示，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)的是活細(xì)胞；核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀的是早期凋亡細(xì)胞；核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)是非凋亡的死亡細(xì)胞；核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀是晚期凋亡細(xì)胞。AO/EB染色定量結(jié)果顯示，與C組相比，L組凋亡細(xì)胞數(shù)極顯著增加(P<0.01)；與L組相比，L+NCsiRNA組凋亡細(xì)胞數(shù)無明顯變化(P>0.05)，L+siChTLR4組凋亡細(xì)胞數(shù)極顯著降低(P<0.01)，L+pCMV-HA-N組凋亡細(xì)胞數(shù)無明顯變化(P>0.05)，L+pCMV-HA-TLR4組凋亡細(xì)胞數(shù)極顯著升高(P<0.01)，詳見圖5b。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(圖5c)顯示，采用AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測MSB1細(xì)胞的凋亡率，流式細(xì)胞術(shù)定量結(jié)果顯示，與C組相比，L組凋亡率極顯著增加(P<0.01)，與L組相比，L+NCsiRNA組凋亡率變化不明顯(P>0.05)，L+siChTLR4組凋亡率極顯著降低(P<0.01)，L+pCMV-HA-N組凋亡率變化不明顯(P>0.05)，L+pCMV-HA-TLR4組凋亡率極顯著升高(P<0.01)，詳見圖5d。

a. AO/EB熒光染色(比例尺，100 μm)；b. Image J熒光定量強(qiáng)度分析AO/EB熒光染色；c. 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果；d.流式細(xì)胞術(shù)的定量結(jié)果(n=3)。與對照組相比，*.P<0.05,**. P<0.001;與缺硒組相比，#.P<0.05,##.P<0.001。下同

2.4 硒缺乏誘導(dǎo)MSB1細(xì)胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及凋亡相關(guān)基因的mRNA和蛋白的表達(dá)

2.4.1 TLR4干擾和過表達(dá)效果 qRT-PCR和Western blot結(jié)果(圖6)顯示，與C組相比，L組TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)極顯著增加(P<0.01)，與L組相比，L+NCsiRNA組和L+pCMV-HA-N組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平未發(fā)生明顯改變(P>0.05)，L+siChTLR4組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)，L+pCMV-HA-TLR4組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。

a.MSB1細(xì)胞中TLR4的mRNA表達(dá)水平；b. MSB1細(xì)胞Western blot檢測結(jié)果；c. TLR4的灰度值分析

2.4.2 干擾和過表達(dá)TLR4后對MSB1細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及凋亡相關(guān)基因的影響 qRT-PCR和Western blot結(jié)果(圖7)顯示，與C組相比，L組MyD88、NF-κB、Caspase-3、Caspase-9、Bax的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，L組Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。與L組相比，L+siChTLR4組的MyD88、NF-κB、Caspase-3、Caspase-9、Bax的mRNA和蛋白表達(dá)極顯著降低(P<0.01)，Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)，與L組相比，L+pCMV-HA-TLR4組的MyD88、NF-κB、Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA和蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。

a～f.MSB1細(xì)胞中MyD88、NF-κB、Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)水平；g. MSB1細(xì)胞Western blot檢測結(jié)果；h～m. MSB1細(xì)胞中MyD88、NF-κB、Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2的灰度值分析。

3 討 論

3.1 硒缺乏對胸腺形態(tài)學(xué)變化的影響

胸腺組織結(jié)構(gòu)的正常才能確保機(jī)體發(fā)揮正常的功能，胸腺組織損傷會影響機(jī)體的免疫功能。正常的胸腺組織被膜和胸腺小葉結(jié)構(gòu)完整，皮質(zhì)髓質(zhì)界限清晰，淋巴細(xì)胞密集且完整[24]。有研究表明，硒缺乏會導(dǎo)致雞胸腺小葉結(jié)構(gòu)紊亂、有輕度的萎縮，出現(xiàn)壞死，并伴有少量的出血，淋巴細(xì)胞排列疏松無規(guī)則[25]。還有研究表明，硒缺乏會導(dǎo)致胸腺皮質(zhì)區(qū)域變薄，胸腺小葉的髓質(zhì)明顯擴(kuò)張，網(wǎng)狀上皮細(xì)胞明顯增加。胸腺小葉的皮質(zhì)髓質(zhì)中的淋巴細(xì)胞明顯減少，并且分布稀疏。本試驗(yàn)結(jié)果表明，硒缺乏影響雞胸腺組織生長發(fā)育，導(dǎo)致胸腺組織發(fā)生損傷，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞排列紊亂、皮質(zhì)髓質(zhì)充血、核碎裂，廣泛的局灶性壞死。

在超微結(jié)構(gòu)觀察中，硒缺乏會顯著增加淋巴細(xì)胞變性壞死的數(shù)量，然而這些淋巴細(xì)胞會被網(wǎng)狀的巨噬細(xì)胞吞噬。通過超微病理學(xué)觀察，亦見胸腺網(wǎng)狀細(xì)胞線粒體發(fā)生退行性變，進(jìn)一步證明了網(wǎng)狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷可能導(dǎo)致胸腺的萎縮以及淋巴細(xì)胞減少[27]。硒缺乏組胸腺淋巴細(xì)胞外周血和中央淋巴細(xì)胞染色質(zhì)異常，淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞內(nèi)的線粒體腫脹。本試驗(yàn)結(jié)果表明，硒缺乏組雞胸腺組織淋巴細(xì)胞間出現(xiàn)裂隙，體積縮小，細(xì)胞碎裂，核染色質(zhì)邊集，線粒體腫脹，嵴斷裂。

3.2 硒缺乏對細(xì)胞凋亡的影響

在缺硒狀態(tài)下，抗氧化酶(TRXR和GPX)活性降低，ROS產(chǎn)生，信號級聯(lián)的氧化還原調(diào)節(jié)紊亂，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和COX-2的表達(dá)增加，導(dǎo)致炎癥和凋亡增加。有報道Gpx3、Gpx4、Dio1、Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、SelS、Selpb基因與促凋亡Caspase-3基因呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，與抗凋亡Bcl-2基因呈強(qiáng)正相關(guān)。硒蛋白W(SelW)通過抑制炎癥和細(xì)胞凋亡來保護(hù)免疫器官免受氧化應(yīng)激的影響[31]，硒蛋白K(SelK)通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動未折疊蛋白反應(yīng)，以限制ROS的產(chǎn)生，從而防止過度自噬介導(dǎo)的降解和凋亡死亡。硒化合物(亞硒酸鹽、硒納米顆粒、硒代蛋氨酸、硒二谷胱甘肽、亞硒酸等)的生物學(xué)效應(yīng)，均取決于濃度，低濃度硒化合物只調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原，而高濃度硒誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和凋亡。硒納米粒子(NPs)引起Caspases-3、Caspases-8和Caspases-9的劑量依賴性激活，并增加FADD表達(dá)，以及過度產(chǎn)生活性氧ROS，導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果均提示，不同存在形式的硒均與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在本研究中，通過檢測缺硒組雞胸腺組織中凋亡相關(guān)因子(Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2)mRNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)呈促凋亡趨勢變化，又在體外通過流式細(xì)胞術(shù)和AO/EB染色檢測低硒條件下MSB1細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)MSB1細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，本研究的結(jié)果和以上的研究發(fā)現(xiàn)相對一致，所以得出硒缺乏導(dǎo)致胸腺發(fā)生細(xì)胞凋亡。

3.3 TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對細(xì)胞凋亡的影響

當(dāng)TLR與配體結(jié)合后，TLR的TIR發(fā)生變構(gòu)，MyD88的C端區(qū)域與TIR結(jié)合，N端通過死亡結(jié)構(gòu)域(DD)募集同樣含有死亡作用域的IRAK，導(dǎo)致IRAK自身磷酸化，磷酸化的IRAK從MyD88上脫離并與TRAF6結(jié)合，TRAF6活化絲裂激活蛋白激酶家族成員中的NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)，NIK自身磷酸化激活I(lǐng)κKs，導(dǎo)致IκB的泛素化并從IκB/NF-κB復(fù)合物中釋放，NF-κB被激活，而NF-κB能通過上調(diào)促凋亡因子Bax，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡[37]。當(dāng)使用siRNA敲除TLR4基因后，發(fā)現(xiàn)可以抑制Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax的激活從而防止小鼠心肌凋亡，還有研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)也通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路來抑制炎癥和細(xì)胞凋亡，還有研究通過分別下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子，來抑制KOA大鼠滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡，從而保護(hù)滑膜損傷。以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR4可能通過MyD88/NF-κB信號通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為驗(yàn)證這個結(jié)論，本研究體外試驗(yàn)中，分別干擾和過表達(dá)TLR4后，通過檢測信號通路(TLR4/MyD88/NF-κB)和凋亡相關(guān)因子(Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)分別干擾和過表達(dá)TLR4后會調(diào)控MyD88/NF-κB信號通路以及凋亡相關(guān)因子的改變。綜上所述，表明TLR4/MyD88/NF-κB信號通路參與細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

硒缺乏通過 TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路介導(dǎo)雞胸腺細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步誘導(dǎo)雞胸腺損傷。