劉志勇 褚愛春

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫性疾病，其特點是患者體內(nèi)存在大量自身抗體，特別是抗核抗體，會導致腎臟、肺和心臟等多器官損傷[1-2]。目前認為SLE的病因是多因素的，包括遺傳、激素和環(huán)境等，但其分子機制尚不明確[3]。SLE患者和動物模型的研究表明氧化應(yīng)激在SLE發(fā)病中起重要作用[1]?；钚匝踝杂苫?ROS)的大量產(chǎn)生和氧化還原狀態(tài)改變可能是SLE產(chǎn)生自身抗體和各種臨床特征的重要因素[4]。姜黃素是從植物姜黃中提取的一種多酚化合物，據(jù)報道其可減輕炎癥，抑制自身免疫反應(yīng)，是一種安全高效的抗炎和抗氧化藥物[5-7]。既往研究結(jié)果表明姜黃素可通過上調(diào)或下調(diào)相關(guān)基因的表達來誘導其產(chǎn)生抗氧化酶，從而改善氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗氧化作用[8-9]。目前發(fā)現(xiàn)姜黃素對系統(tǒng)性硬化癥[10]、類風濕關(guān)節(jié)炎[11]等多種疾病具有良好的治療效果。本研究采用姜黃素對SLE小鼠模型進行干預(yù)，觀察小鼠血清氧化與抗氧化應(yīng)激指標的變化，探討姜黃素對SLE的抗氧化效果及其保護作用。

材料與方法

1.材料：6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠各20只，均購自于中國科學院上海實驗動物中心，在有正常食物和水的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫22～25 ℃，白天/黑夜12 h循環(huán)。姜黃素購自美國Sigma-Aldrich公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司，一氧化氮(NO)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國R&D公司，小鼠抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體檢測試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司，水合氯醛晶體由武漢大學人民醫(yī)院藥劑科提供。

2.方法

(1)動物分組和干預(yù)措施：將20只BALB/c小鼠隨機分為正常組10只和正常干預(yù)組10只；將20只MRL/lpr小鼠隨機分為模型組10只和模型干預(yù)組10只。正常組和模型組小鼠不做任何處理。正常干預(yù)組和模型干預(yù)組小鼠用混合有姜黃素(500 mg·kg-1·d-1)的玉米油0.5 ml灌胃，連續(xù)4周。姜黃素用量根據(jù)參考文獻[12]按體重換算確定。

(2)標本采集：按照上述措施處置4周后，用腹腔注射4%水合氯醛的方法麻醉小鼠，打開胸腔，直視下用1 ml空針注射器于心尖部采血0.5～1.0 ml，常規(guī)離心5 min，吸取上層血清置于試劑管中，于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。在動物處死?天留取尿液標本，每只小鼠分別放在1個代謝籠中，收集24 h尿液，標本置于-20 ℃冰箱保存用于總尿蛋白排泄分析。

(3)血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標水平測定：取室溫復融的上清液0.1 ml，采用硝酸還原酶法測定NO水平，按試劑盒操作步驟混勻標本，于550 nm波長處讀取各標本OD值，然后計算各樣本NO水平。MDA水平測定是基于分光光度法測定硫代巴比妥酸(TBA)和MDA形成的粉紅色產(chǎn)物，取1 ml上清液，加入75 μl 0.10 M乙二胺四乙酸(EDTA)和250 μl的1% TBA溶液，沸水浴15 min，于532 nm處測定OD值，根據(jù)試劑盒說明書計算MDA水平。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD水平，根據(jù)試劑盒操作要求處置樣品，于550 nm波長處測定各標本OD值，計算SOD水平。采用化學比色法測定GSH-PX水平，于412 nm處測定各標本OD值，計算GSH-PX水平。

(4)小鼠抗ds-DNA抗體水平測定：采用雙抗夾心ELISA法測定血清抗ds-DNA抗體水平，將生物素標記抗體加入待測血清標本中，37 ℃溫箱孵育1 h，洗凈后加入80 μl親和鏈酶素-辣根過氧化物酶(HRP)，振蕩混勻，在37 ℃溫箱孵育30 min；洗凈后加入50 μl A、B底物，搖勻，繼續(xù)在37 ℃溫箱孵育后立刻加入終止液，于450 nm波長處計算結(jié)果代表抗ds-DNA抗體水平。

(5)小鼠24 h尿蛋白水平測定：根據(jù)試劑盒說明書按步驟進行測定，采用酶標儀(Bio-rad,Japan)于450 nm波長處測定各管OD值，計算各標本24 h尿蛋白水平。

結(jié) 果

4組小鼠血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標、抗ds-DNA抗體及24 h尿蛋白水平比較：4組小鼠血清NO、MDA、SOD、GSH-PX、抗ds-DNA抗體及24 h尿蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組小鼠血清NO、MDA、抗ds-DNA抗體及24 h尿蛋白水平均明顯升高，而血清SOD和GSH-PX水平均明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，模型干預(yù)組小鼠血清NO、MDA、抗ds-DNA抗體及24 h尿蛋白水平均明顯下降，而血清SOD和GSH-PX水平均明顯升高(P<0.05)。正常組和正常干預(yù)組小鼠上述指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組小鼠血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標、抗ds-DNA抗體及24 h尿蛋白水平比較

討 論

目前研究認為氧化應(yīng)激可能是SLE病理特征中細胞死亡信號異常暴露和反應(yīng)的基礎(chǔ)。SLE患者免疫系統(tǒng)異常激活，氧化應(yīng)激觸發(fā)凋亡和壞死細胞釋放核碎片，刺激抗核抗體產(chǎn)生，進而引發(fā)炎癥和器官損傷[13]。SLE的發(fā)生發(fā)展與ROS的過度產(chǎn)生及無效清除有關(guān)。研究表明，SLE患者血液中存在不同成分的ROS生成增加或細胞內(nèi)還原性谷胱甘肽水平降低，而使用抗氧化劑恢復氧化還原平衡或通過攝入抗氧化營養(yǎng)素(如維生素A、C、胡蘿卜素等)減少氧化應(yīng)激的影響，可減輕SLE患者各種氧化應(yīng)激誘導的并發(fā)癥[1]。

研究發(fā)現(xiàn)姜黃素是一種強效的抗氧化劑，其正甲氧基提供的氫可與ROS發(fā)生氧化反應(yīng)，有助于清除循環(huán)系統(tǒng)中的ROS[14]。姜黃素還能增加抗氧化酶的表達，如SOD、GSH-PX和過氧化氫酶等，且姜黃素能通過激活細胞內(nèi)的抗氧化基因來清除ROS，保護細胞免受氧化應(yīng)激誘導的損傷，從而降低細胞毒性，減弱繼發(fā)效應(yīng)[15]。既往動物實驗已證實姜黃素對肝臟和心臟等器官具有明顯的抗氧化保護作用。在Macías-Pérez等[16]的一項關(guān)于肝損傷的動物實驗中發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)倉鼠肝實質(zhì)損傷。Naghdi等[17]研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素具有較強的抗氧化性能，有助于改善1型糖尿病誘導的氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)糖尿病誘導的心臟組織損傷。

在氧化應(yīng)激損傷生物膜后，MDA能夠反映不飽和脂肪酸過氧化的情況，而過量表達的NO能使微小血管滲透性增高，破壞局部組織器官微循環(huán)。發(fā)揮抗氧化作用的SOD可氧化還原ROS，維持機體氧化應(yīng)激平衡；GSH-PX則可清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過氧化物，保護機體免受損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清NO和MDA水平明顯升高，而血清SOD和GSH-PX水平明顯降低，表明SLE小鼠體內(nèi)存在氧化應(yīng)激。同時，我們還發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清抗ds-DNA抗體及24 h尿蛋白水平與正常組相比也明顯升高，提示氧化應(yīng)激與SLE的病情進展及腎臟損傷緊密相關(guān)。然而用姜黃素干預(yù)4周后，模型干預(yù)組小鼠血清SOD和GSH-PX水平均高于模型組，而NO和MDA水平均低于模型組，表明姜黃素能夠抑制SLE小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，模型干預(yù)組小鼠血清抗ds-DNA抗體和24 h尿蛋白水平明顯降低，表明姜黃素對SLE模型小鼠有明顯的治療效果。這與既往研究結(jié)果一致，Elena等[12]發(fā)現(xiàn)姜黃素能調(diào)節(jié)SLE小鼠的自身免疫活動，并能減輕腎損傷；Abdul Kadhim等[19]在環(huán)孢素A所致腎損傷的動物實驗中發(fā)現(xiàn)，姜黃素可明顯降低大鼠血清MDA水平，顯著提高抗氧化酶活性，減輕環(huán)孢素A的腎毒性，并使改變的腎臟形態(tài)恢復正常。正常干預(yù)組和正常組小鼠上述各項指標比較差異均無統(tǒng)計學意義，表明姜黃素對正常小鼠無明顯不良反應(yīng)。

綜上所述，SLE模型小鼠存在氧化應(yīng)激的失衡，而姜黃素干預(yù)減輕了SLE小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善了SLE相關(guān)的腎損傷，發(fā)揮了抗氧化保護作用。因此，抗氧化干預(yù)可能是SLE的有益輔助治療方式。