劉江紅,蘇會敏,薛 健

(1.東北石油大學 化學化工學院,黑龍江 大慶 163318;2.黑龍江省環(huán)境科學研究院,黑龍江 哈爾濱 150076;3.哈爾濱澤能環(huán)?？萍加邢薰?黑龍江 哈爾濱 150000)

20世紀60年代微生物固定化技術(shù)應運而生[1],微生物固定化技術(shù)是通過物理和化學的方法將游離的細菌、真菌、酶或細胞等限制在固定區(qū)域內(nèi),單位體積內(nèi)的微生物濃度隨之得到提高,微生物的活性得到了保證[2-3]。大豆分離蛋白是指低溫脫脂豆粨離心分離后得到的蛋白質(zhì),大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)含量高,價格低廉,具有很多優(yōu)良性能,若不加以利用,將會造成極大的浪費[4-5]。Molina Ortiz等[6]探究大豆分離蛋白以2種不同比例包埋酪蛋白水解物,并且通過粒徑大小、溶解性、疏水性、熱力學性質(zhì)等研究考察包埋效果。Xiao J X等[7]探究不同因素對大豆分離蛋白-阿拉伯膠復合物包埋甜橙油的影響,在m(大豆分離蛋白)∶m(阿拉伯膠)＝1∶1,p H＝4的條件下,大豆分離蛋白-阿拉伯膠復合物制成的微膠囊對甜橙油的包埋效果最好。張英華等[8]通過實驗探究在CaCl2存在的條件下,利用大豆分離蛋白形成的冷凝膠包裹乳酸菌,與游離的細菌相比,具有較強的抗酸作用。此外張英華等[9]的另一項實驗研究,葡萄糖酸內(nèi)酯誘導大豆分離蛋白冷凝膠在胃酸p H環(huán)境下對乳酸菌的保護作用,再一次證明了大豆分離蛋白冷凝膠包裹下的細菌,具有抵抗不利環(huán)境條件的能力。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

菌種:從染料廢水樣品中分離、篩選、純化,并在實驗室保存。

亞甲基藍:天津博迪化工股份有限公司;氯化鈣:天津市耀華化工廠;蔗糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、磷酸二氫鉀:天津市塘沽鵬達化工廠;海藻酸鈉:天津市凱通化學試劑有限公司;以上試劑均為分析純;大豆分離蛋白:生物試劑,上?？笊锛夹g(shù)有限公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱:SYQ-DSX-280B,南京曉曉儀器設備有限公司;臺式恒溫振蕩培養(yǎng)箱:HZQX100,常州恒隆儀器有限公司;p H計:p HS-3C,濟南光耀醫(yī)療設備有限公司;可見分光光度計:722E,北京瑞青橙儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的處理

染料降解培養(yǎng)基(MSM):(NH4)2SO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,CaCl2·2H2O 0.01 g,KH2PO41.5 g,K2HPO41.0 g,FeSO4·7 H2O 0.01 g,蔗糖10 g,蒸餾水1 000 m L,p H＝7.0,t＝121℃高壓蒸汽滅菌25 min。

1.2.2 大豆分離蛋白-海藻酸鈉微膠囊的制備

1.2.2.1 大豆分離蛋白溶液和海藻酸鈉溶液的電位測量

使用Zeta電位儀測量p H＝3~7的大豆分離蛋白溶液和海藻酸鈉溶液(兩者質(zhì)量濃度相同)的電位值,每個樣品需重復測量3次,取平均值。

1.2.2.2 大豆分離蛋白-海藻酸鈉儲備溶液的制備

分別配置10 g/L的大豆分離蛋白和海藻酸鈉溶液,其中海藻酸鈉需要加熱溶解,將配置好的2種溶液放置于4℃冰箱中24 h,然后制備1 mol/L的CaCl2溶液。

1.2.2.3 大豆分離蛋白-海藻酸鈉微膠囊固定化青霉菌

取φ(青霉菌孢子)＝1%懸液10 m L,加入ρ(大豆分離蛋白)＝10 g/L和ρ(海藻酸鈉)＝10 g/L溶液,使V(青霉菌孢子懸液)∶V(大豆分離蛋白)∶V(海藻酸鈉)＝1∶5∶1、1∶4∶1、1∶3∶1、1∶2∶1、1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶3、1∶1∶4、1∶1∶5。使用10 m L的一次性無菌注射器分別將上述不同比例的混合溶液緩慢滴加至裝有c(CaCl2)＝1 mol/L溶液的50 m L燒杯中,置于4℃冰箱內(nèi)固化24 h,形成大豆分離蛋白-海藻酸鈉固定化微膠囊,用生理鹽水洗滌3次后浸泡,于4℃冰箱保存,備用,方便后續(xù)實驗的使用。

1.2.3 掃描電鏡觀察

(1)將實驗得到大豆分離蛋白-海藻酸鈉微膠囊用生理鹽水洗凈,加入w(戊二醛)＝2.5%、p H＝6.8的溶液固定,于冰箱中保存12 h。(2)將戊二醛固定后的樣品用生理鹽水沖洗2次。(3)分別用φ(乙醇)＝50%、70%、80%、90%、100%溶液對樣品進行脫水,每次10 min。(4)用φ(叔丁醇)＝50%、70%、80%、90%、100%溶液(由乙醇溶液配置)對樣品進行置換各10 min。(5)用臨界點干燥儀對樣品進行干燥后,將樣品觀察面向上粘貼在掃描電鏡樣品臺上,在其表面鍍一層金屬膜,將預處理好的樣品進行掃描電鏡觀察。

1.2.4 固定化青霉菌微膠囊脫色亞甲基藍的機理探究實驗

選取4個250 m L錐形瓶,分別標記1、2、3和4號,分別加入100 m L染料降解培養(yǎng)基和2 m Lρ(亞甲基藍)＝1 g/L母液,使最終ρ(亞甲基藍)＝20 mg/L,分別進行以下幾種實驗操作。(1)在1號瓶內(nèi)加入大豆分離蛋白粉末5 g,間隔12 h測定吸光度值,計算脫色效率。(2)在2號瓶內(nèi)加入海藻酸鈉粉末5 g,間隔12 h測定吸光度值,計算脫色效率。(3)在3號瓶內(nèi)加入未包裹青霉菌孢子的大豆分離蛋白-海藻酸鈉微膠囊樣品5 g,間隔12 h測定吸光度值,計算脫色效率。(4)在4號瓶內(nèi)加入完好的包裹青霉菌孢子的大豆分離蛋白-海藻酸鈉微膠囊樣品,間隔12 h測定吸光度值,計算脫色效率。將上述4瓶溶液置于n＝120 r/min、t＝35℃振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng),最后對比4瓶亞甲基藍的脫色效率。

1.2.5 不同因素對亞甲基藍脫色效率的影響

考察固定化青霉菌微膠囊脫色亞甲基藍過程中各因素對亞甲基藍脫色效率的影響。亞甲基藍的脫色實驗在初始ρ(亞甲基藍)、p H值(通過滴加0.1 mol/L HCl或Na OH溶液進行調(diào)節(jié))、固定化微膠囊添加量和時間等不同條件下進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化青霉菌微膠囊的性能探究

2.1.1 大豆分離蛋白溶液和海藻酸鈉溶液的電位測量

大豆分離蛋白溶液和海藻酸鈉溶液的電位值隨p H值的變化見圖1。

圖1 大豆分離蛋白溶液和海藻酸鈉溶液的電位值隨pH值的變化

由圖1可知,p H＝3,大豆分離蛋白溶液和海藻酸鈉的電位差值最大為87.9 m V,2種溶液混合,因電位差值相差較大,會迅速聚合發(fā)生反應,形成聚合物,更加有利于固定化微膠囊的合成及穩(wěn)定性,因此選擇p H＝3進行后續(xù)實驗[10-11]。

V(大豆分離蛋白)∶V(海藻酸鈉)＝1∶1形成的固定化微膠囊的宏觀圖見圖2。

圖2 固定化微膠囊的宏觀圖

由圖2可知,V(大豆分離蛋白)∶V(海藻酸鈉)＝1∶1形成的微膠囊直徑適中、大小均一,基本沒有拖尾情況,由此方法制備的微膠囊,浸泡于生理鹽水中,放置于4℃的冰箱里,保存超過3個月形態(tài)沒有變化,可繼續(xù)用于實驗使用。

2.1.2 固定化青霉菌微膠囊的掃描電鏡觀察

固定化青霉菌微膠囊的掃描電鏡圖見圖3。

圖3 固定化青霉菌微膠囊的掃描電鏡圖

由圖3a和圖3b可知,微膠囊表面致密,致密結(jié)構(gòu)可以防止外界環(huán)境不利因素入侵,保護內(nèi)部包裹的青霉菌孢子。圖3c是微膠囊切開后的橫切面的掃描電鏡圖,將切面部分放大100倍后得到圖3d,由圖3d可知,微膠囊具有多孔結(jié)構(gòu),內(nèi)部的青霉菌孢子可以通過這些孔道吸收培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì),供青霉菌的生長,同時亞甲基藍染料也可以通過這些孔道進入微膠囊內(nèi)部。這種疏松多孔結(jié)構(gòu)具有很好的吸附作用,可以有效提高亞甲基藍的脫色效率。

2.2 固定化青霉菌微膠囊機理探究

固定化青霉菌微膠囊機理的實驗探究見圖4。

圖4 固定化青霉菌微膠囊機理的實驗探究

由圖4可知,t＞24 h,甲基藍的脫色率1號瓶僅為4.01%;2號瓶僅為1.71%,可見大豆分離蛋白和海藻酸鈉2種固定化材料對亞甲基藍的脫色作用較 小;3號 瓶為34.98%,4號 瓶 為94.21%。t＞48 h,亞甲基藍的脫色率為97.02%,由此可知大豆分離蛋白-海藻酸鈉微膠囊結(jié)構(gòu)和青霉菌對亞甲基藍具有吸附作用。

2.3 不同因素對亞甲基藍脫色效率的影響

不同因素對亞甲基藍脫色率的影響見圖5。由圖5a可知,青霉菌經(jīng)過微膠囊固定化后,ρ(亞甲基藍)＝20 mg/L,脫色率達到98.01%;由圖5b可知,青霉菌經(jīng)過微膠囊固定后,亞甲基藍的脫色率先增加后降低;由圖5c可知,固定化青霉菌添加量為3.0 g,亞甲基藍的脫色率達到94.59%;由圖5d可知,青霉菌經(jīng)過微膠囊固定后,隨著時間的增加,亞甲基藍脫色率迅速增加,在達到最大效率后,脫色率逐漸趨于穩(wěn)定。固定化后的青霉菌與固定前的游離菌相比,顯著提高了對亞甲基藍的脫色率。

圖5 不同因素對亞甲基藍脫色效率的影響

3 結(jié) 論

(1)以大豆分離蛋白和海藻酸鈉作為固定化材料固定青霉菌,使用Zeta電位儀進行電位分析,通過性能測試確定最佳合成條件為m(大豆分離蛋白)∶m(海藻酸鈉微膠囊)＝1∶1,p H＝3。通過透射電鏡探究大豆分離蛋白-海藻酸鈉微膠囊,可觀察到疏松多孔結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)有助于后續(xù)實驗過程中對亞甲基藍的脫色;

(2)由機理探究部分的實驗數(shù)據(jù)可知,大豆分離蛋白和海藻酸鈉單一的固定化材料對亞甲基藍的脫色率很低,固定化后亞甲基藍的脫色主要是固定化結(jié)構(gòu)和青霉菌的吸附作用導致;

(3)考察不同因素對固定化青霉菌的影響可知,固定化青霉菌后,可以有效抵抗強酸強堿、高質(zhì)量濃度亞甲基藍等不利因素的影響。