樊輕亞，汪學(xué)猛

（信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 信陽 464000）

沙苑子為豆科一年生草本植物扁莖黃芪的成熟種子，內(nèi)含蛋白質(zhì)、多肽，黃酮類、鞣質(zhì)、維生素A類物質(zhì)等化學(xué)成分。研究表明，其具有抗衰老、抗腫瘤、調(diào)脂和保肝等作用[1-6]。此外，沙苑子也有明顯的體外抗氧化活性。相對(duì)藥材黃芪來說，沙苑子的研究尚處起步階段，隨著黃芪種植面積的加大，沙苑子的產(chǎn)量也隨之增加，多余資源的開發(fā)問題將提上日程。

自由基學(xué)說認(rèn)為，自由基攻擊生命大分子造成組織細(xì)胞損傷，是引起機(jī)體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要起因。因此有效的自由基清除劑一直是近年的研究熱點(diǎn)。植物中含有眾多消除活性氧自由基的抗氧化類功能因子，從植物中尋找高效、廉價(jià)、低毒的天然抗氧化劑成為目前發(fā)展的一個(gè)必然趨勢[7-10]。本文旨在探索從沙苑子中提取蛋白質(zhì)的最佳條件，并對(duì)其體外內(nèi)抗氧化能力方面的藥用價(jià)值進(jìn)行研究，為其在功能食品、保健食品、化妝品和藥品等方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Cary 50 紫外分光光度計(jì)（美國Varian公司）；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；LGJ-10B型冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；KDC-1044低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH，F(xiàn)luka公司）；抗壞血酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院）；鹽酸、氫氧化鈉、石油醚、無水乙醇均為分析純。沙苑子，安徽亳州藥材市場。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)自提取實(shí)驗(yàn)

1）材料預(yù)處理。取材料沙苑子粉碎，過2號(hào)篩，粉末用濾紙包好置入索氏提取器中用石油醚（30~60 ℃）浸泡1夜，次日，于水浴鍋在46 ℃回流提取，提取時(shí)間24 h，最大量的除去油脂，提取液回收石油醚及油，渣晾干，備用。

2）蛋白質(zhì)提取方法。采用堿提酸沉法從沙苑子中提取分離蛋白質(zhì)。工藝流程：籽料→除雜→粉碎→過篩→堿液提取→離心→上清液調(diào)酸→過濾→沉淀干燥→成品。

3）常溫磁力攪拌法。稱取10 g渣料，加入一定比例的蒸餾水，攪拌均勻，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為10～11，常溫磁力攪拌1 h，低速離心4 000 r·min-1離心10 min，殘?jiān)匦绿崛?，合并兩次上清液?/p>

4）加熱磁力攪拌法。稱取10 g渣料，加入一定比例的蒸餾水，攪拌均勻，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為10～11，50 ℃條件下磁力攪拌1 h，離心取沉淀，殘?jiān)匦绿崛?，合并兩次上清液?/p>

5）常溫超聲提取法。稱取10 g渣料，加入一定比例的蒸餾水，攪拌均勻，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為10～11，超聲提取1 h，低速離心10 min，殘?jiān)匦绿崛。喜纱紊锨逡骸?/p>

6）加熱超聲提取法 稱取10 g渣料，加入一定比例蒸餾水，攪拌均勻，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為10～11，50 ℃超聲提取1 h，離心取沉淀，殘?jiān)匦绿崛?，合并兩次上清液?/p>

7）將上述常溫磁力攪拌、加熱磁力攪拌、常溫超聲提取、加熱超聲提取的上清液，分別加1 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，放冰箱靜置1夜。離心取沉淀，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為中性，冷凍干燥24 h、稱重，得棕色沙苑子蛋白質(zhì)。

1.2.2 粗蛋白得率計(jì)算方法

式中：m1—干燥后蛋白質(zhì)質(zhì)量；

m2—提取前原料質(zhì)量。

1.2.3 抗氧化實(shí)驗(yàn)[11-13]

1）溶液配制。稱取0.039 4 g DPPH, 用無水乙醇配制成濃度為0.001 mol·L-1DPPH溶液。

稱取0.005 g蛋白質(zhì)提取物，用無水乙醇定容配制成質(zhì)量濃度分別為 0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1樣品溶液。

稱取0.005 g抗壞血酸，用無水乙醇定容配制成質(zhì)量濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1抗壞血酸溶液，避光保存。

2） 清除DPPH自由基 以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，根據(jù)呈深紫色的DPPH 甲醇溶液，在最大吸收峰 517 nm 處褪色程度測定沙苑子蛋白質(zhì)的DPPH 清除能力。

DPPH自由基清除率計(jì)算式：

式中：At—樣品和DPPH混合液的吸光度；

A0—溶劑和DPPH混合液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)沙苑子蛋白得率和蛋白純度的影響

由圖1（a）可見，不同的提取方式對(duì)于沙苑子的蛋白質(zhì)得率有影響，磁力攪拌隨著溫度的提高，得率有所增加；而超聲提取時(shí)，隨著溫度的提高，蛋白質(zhì)反而下降。

圖1 不同提取方法對(duì)沙苑子的蛋白得率（a）和蛋白質(zhì)純度（b）的影響

由圖1（b）可見，不同的提取方式對(duì)于沙苑子的蛋白質(zhì)純度影響頗大，在常溫磁力攪拌條件下，蛋白質(zhì)純度較高，達(dá)78%；伴隨溫度的提高，純度有所下降；而超聲提取時(shí)，伴隨溫度的提高，蛋白質(zhì)純度下降?？傮w磁力攪拌所得蛋白質(zhì)純度均高于超聲提取法所得蛋白質(zhì)；溫度提高，可能影響到蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，故純度均降低。

綜圖1所示，沙苑子粗蛋白的得率與純度與提取溫度有直接關(guān)系，超過30 ℃，蛋白質(zhì)純度降低，故提取時(shí)盡量保持常溫；冷藏和冷凍時(shí)也需控制溫度，否則蛋白質(zhì)變性影響后期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

2.2 不同提取方法對(duì)主要氨基酸的影響

由圖2可見，不同方法得到的粗蛋白中必需氨基酸有不同程度變化，隨溫度升高，提取率有所增加，其中磁力攪拌法提取氨基酸的效率高于超聲提取。

圖2 不同提取方法得到的粗蛋白中必需氨基酸含量（g·100 g-1）

但對(duì)比黑豆、黃豆的營養(yǎng)成分，沙苑子中的甲硫氨酸含量很高，對(duì)養(yǎng)殖方面是一種優(yōu)秀的資源，值得開發(fā)。

2.3 DPPH自由基的清除作用

抗壞血酸質(zhì)量濃度和蛋白質(zhì)提取物質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除率的影響見圖3。

由圖3（a）可見，DPPH自由基清除率隨抗壞血酸濃度的增加而增加。由圖3（b）可見，沙苑子蛋白質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除率隨提取物質(zhì)量濃度的增加而增加，表明沙苑子粗蛋白有明顯的清除作用，在其質(zhì)量濃度為 0.1 g·L-1時(shí)，清除率高達(dá)50.64%，表明沙苑子粗蛋白可作為抗氧化藥物和保健品的資源。

圖3 抗壞血酸質(zhì)量濃度（a）和沙苑子蛋白質(zhì)量濃度（b）對(duì)DPPH自由基清除率的影響

3 結(jié) 論

本文用堿提酸沉法輔助不同的提取方式，考察蛋白質(zhì)最佳提取方案，為沙苑子蛋白質(zhì)開發(fā)打下良好的基礎(chǔ)。本文研究表明，沙苑子清除自由基的能力與其蛋白含量有關(guān)，據(jù)此推斷沙苑子改善血液流變學(xué)指標(biāo)、抗衰老、降脂保肝、抑制血小板聚集、增強(qiáng)免疫功能等作用也可能與其抗氧化活性和蛋白質(zhì)含量有關(guān)。后繼可進(jìn)一步開發(fā)沙苑子的有效成分，揭示沙苑子的藥理作用機(jī)制，促進(jìn)沙苑子資源的開發(fā)利用。