李超，鐘維，朱磊，黃鈺淇2,，李錦意，陳永鋒

1.深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020；2.廣東醫(yī)科大學，廣東 湛江 524000；3.南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)是全球人群中第二常見的皮膚惡性腫瘤，起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細胞。紫外線照射是公認的重要危險因素，其他還包括皮膚慢性潰瘍、光化性角化病等癌前病變、基因突變和免疫因素等[1]。CSCC發(fā)病機制復雜，目前研究涉及的相關(guān)基因通路較多，其中RTK通路作為增殖、分化的主要通路，已被明確作為CSCC的發(fā)病機制之一。Sprouty 2是RAS/絲裂原活化蛋白激酶(RAS/MAPK)信號通路中的特異性蛋白，在細胞增殖、遷移、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要作用[2]。Ki-67是一種特殊增殖細胞核抗原，可間接反映腫瘤細胞的增殖，被廣泛用于乳腺癌、淋巴瘤等腫瘤研究[3]。上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin, E-cad)是腔上皮細胞中經(jīng)典跨膜蛋白，通過內(nèi)吞和胞吐的空間調(diào)控作用參與細胞黏附、細胞極性及細胞重排[4]。Sprouty 2在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用不盡相同，其在皮膚腫瘤中的研究極少[5]，與CSCC是否有關(guān)至今未有報道。本研究通過分析CSCC中Sprouty 2的表達及其與E-cad和Ki-67的相關(guān)性，為探索Sprouty 2在CSCC發(fā)病中的臨床意義提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2018年3—7月在南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院皮膚科就診且病理診斷為高分化，即Broders分級Ⅰ級(未分化細胞占全部癌細胞比例<25%)～Ⅱ級(未分化細胞占25%～50%)的頭面部CSCC患者[6]。所有患者術(shù)前均未行放療、化療，未應(yīng)用免疫抑制劑、冷凍、激光等治療。排除標準：炎癥性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病或其他嚴重的慢性系統(tǒng)性疾病患者。共納入15例患者作為病例組，其中男9例，女6例；年齡50～86(63.13±15.79)歲；病程3個月～10年。健康對照組10例，全部為南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院行頭面部整形手術(shù)的健康人，男女各5例，年齡33～77(57.30±10.07)歲。病例組與對照組的性別(P=0.70)和年齡(t=1.03,P=0.31)比較,差異均無統(tǒng)計學意義。研究方案根據(jù)赫爾辛基宣言的原則設(shè)計和實施，并經(jīng)南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批件號：2017028)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人Sprouty 2多克隆抗體(一抗，ab85670，美國Abcam)、抗E-cad抗體(一抗，24E10，美國Cell Signaling)、抗Ki-67抗體(一抗，ARG53222，臺灣Arigo)、羊抗兔多克隆IgG抗體(二抗，ARG65351，臺灣Arigo)、抗GAPDH抗體(ab181602，美國Abcam)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time )(日本Takara)、SYBR Prime Ex TaqTM Ⅱ(日本Takara)。Nano Drop儀(美國Thermo Fisher Scientific)、 Light Cycler 480 PCR儀(瑞士Roche)、iQ5多色實時PCR檢測系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1 標本取材 所有受試者均在頭面部取材，手術(shù)切除所需標本，大小約為10 mm×5 mm×3 mm，以癌灶標本作為鱗癌組，以臨近癌灶的標本作為癌旁組，以遠離癌灶的標本作為病例對照組，以健康人標本作為健康對照組。每組標本分成3份，1份制成蠟塊，另外2份裝無菌凍存管在液氮內(nèi)凍存。

1.3.2 免疫組化檢測組織標本中Sprouty 2、E-cad和Ki-67的表達 取標本蠟塊做4 μm厚度切片待用，脫蠟后置于3% H2O2溶液孵育10 min，隨后浸入1×抗原修復液中加熱20 min；分組滴加50 μL抗 Sprouty 2(1 ∶400)、E-cad(1 ∶400)和 Ki-67(1 ∶200)抗體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次。滴加羊抗兔多克隆抗體(1 ∶500)，37 ℃水浴20 min，PBS沖洗3次；顯色、復染后，于光學顯微鏡下觀察目的蛋白細胞定位及分布情況。用Image Pro軟件對陽性染色部位進行測量分析，計算平均光密度(AOD)，AOD=累積光密度/面積。

1.3.3 qRT-PCR檢測鱗癌組、癌旁組、病例對照組和健康對照組 Sprouty 2表達 提取組織總RNA：凍存組織稱重、研磨，加Trizol試劑裂解、氯仿萃取，離心后取上清并加入異丙醇混勻；再次離心，取白色沉淀物即組織總RNA；超純水溶解后用NanoDrop儀檢測RNA濃度，達標后將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

qRT-PCR：以GAPDH為內(nèi)參照。Sprouty 2正向引物：5′-CCCCTCTGTCCAGATCCATA-3′，反向引物：5′-CCCAAATCTTCCTTGCTCAG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)正向引物：5′-AAGTATGACAACAGCCTCAAG-3′，反向引物：5′-TCCACGATACCAAAGTTGTC-3′。采用20 μL反應(yīng)體系，在無RNA酶八聯(lián)管中分別加入10 μL SYBR Prime Ex TaqTM、1 μL cDNA、7 μL超純水、正反向引物各1 μL。擴增條件95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,40個循環(huán)。熒光融解得到融解曲線。以2-ΔΔCt表示基因mRNA表達水平。

1.3.4 Western blot檢測組織標本中Sprouty 2和E-cad表達 提取凍存組織總蛋白后選擇10%二烷基硫酸銨-聚丙烯酰胺凝膠，加樣后恒壓電泳；轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯膜后再次恒流電泳；取出聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)至封閉液恒溫37 ℃搖床勻速搖60 min；取膜置于一抗稀釋液(Sprouty 2、E-cad抗體工作濃度均為1 ∶1 000，GAPDH抗體為1 ∶10 000)中過夜；次日加入羊抗兔IgG抗體(1 ∶5 000)孵育60 min，暗房顯影。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析。多組間Sprouty 2 mRNA水平等比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用Bonferroni法。Sprouty 2與E-cad、Ki-67相關(guān)性采用Pearson或Spearman相關(guān)分析法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Sprouty 2 mRNA水平表達

結(jié)果顯示,4組間Sprouty 2 mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(2=55.00,P<0.01)；兩兩比較，鱗癌組Sprouty 2 mRNA表達低于癌旁組(Z=-4.12)、病例對照組(Z=-4.74)和健康對照組(Z=-4.22),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。

表1 各組皮膚組織中Sprouty 2 mRNA和蛋白以及E-cad、Ki-67蛋白的表達水平Table 1 Expression levels of Sprouty 2, E-cad and Ki-67 mRNA and protein in skin tissues of each group

2.2 Western blot檢測結(jié)果

圖1 Western blot檢測Sprouty 2和E-cad蛋白在各組皮膚組織中的表達

2.3 免疫組化檢測結(jié)果

圖2 免疫組化檢測Sprouty 2、E-cad、Ki-67在鱗癌組、癌旁組、病例對照組及健康對照組皮膚中的表達(200×)

2.4 皮膚鱗狀細胞癌中Sprouty 2與E-cad、Ki-67相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示,Sprouty 2與E-cad呈正相關(guān)(r=0.59，P=0.021)；Pearson相關(guān)分析顯示,Sprouty 2與Ki-67呈負相關(guān)(r=-0.59，P=0.022)。

3 討論

CSCC是起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細胞的一類惡性腫瘤，其發(fā)病機制復雜，病因尚不明確，目前研究涉及的相關(guān)基因通路包括TP53通路、NOTCH通路、RAS通路、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)通路、SRC家族激酶通路、CDKN2A通路、核因子KB通路、轉(zhuǎn)化生長因子β通路和KNSTRN通路等[7]。在無脊椎動物和脊椎動物中受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)通路主要在器官形態(tài)形成和發(fā)育、細胞增殖和分化等方面發(fā)揮作用，過度或不受調(diào)控的RTK信號會導致腫瘤形成、病理性新生血管形成和異常發(fā)育[8]。該通路由RAS-RAF-MEK-MAPK級聯(lián)反應(yīng)和PI3K-AKT通路調(diào)節(jié)，這兩個通路由負反饋環(huán)路調(diào)節(jié),其中RAS-MAPK信號通路是細胞內(nèi)增殖、分化中至關(guān)重要的信號通路[9]。在動物實驗中，RAS原癌基因調(diào)控異常參與了小鼠化學致癌模型CSCC的發(fā)生[10-11]。此外，日光損傷皮膚(如日光性角化病)中也存在RAS突變，表明RAS突變可能是紫外線損傷引起癌前病變的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]。通過分子分析、獨立驗證集和功能研究分析發(fā)現(xiàn)，接受BRAF抑制劑治療的黑素瘤患者發(fā)生的CSCC致癌突變中，以HRAS Q61L最常見，而HRAS Q61L突變株增殖與RAS-MAPK通路信號通路和ERK介導的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率盒1蛋白可通過增加p85 PI3K、AKT、p38和P42/44 MAPK的磷酸化水平，顯著激活PI3K/AKT和RAS-MAPK信號通路進而調(diào)控CSCC轉(zhuǎn)移[14]。由上可知，RTK信號通路活化異常在CSCC的病理生理機制中扮演著重要角色。

Sprouty 2是RAS信號通路特異性抑制蛋白，可抑制成纖維細胞生長因子介導的ERK活化，也可抑制表皮細胞生長因子介導的AKT活化，從而抑制RTK通路，起到抑制細胞增殖、轉(zhuǎn)化和血管生成的作用[2]。Sprouty 2在腎癌、骨肉瘤、肺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤中的表達下調(diào)，對腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用，已被作為判斷一些疾病如乳腺癌、肝癌的預后獨立因素[15-17]。相反，Dry等[18]發(fā)現(xiàn)黑素瘤細胞系的突變體可上調(diào)Sprouty 2進而促進惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展。Liao等[19]發(fā)現(xiàn)Sprouty 2在人口腔鱗狀細胞癌中過表達。Park等[20]發(fā)現(xiàn)Sprouty 2在膠質(zhì)母細胞瘤表達上調(diào)，并增加了腫瘤細胞的致瘤潛能?？梢奡prouty 2在不同疾病中參與的角色并不完全相同，可與其他因子相互作用從而抑制腫瘤細胞的增殖、分化，也可因自身基因突變促進腫瘤發(fā)生和進展。本研究通過免疫組化、Western blot和qRT-PCR發(fā)現(xiàn),相對于癌旁組、病例對照組和健康對照組，Sprouty 2在CSCC皮損中表達下調(diào)，表明Sprouty 2與CSCC存在相關(guān)性，提示Sprouty 2可能抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，但其下調(diào)的具體機制目前尚不明確，有待進一步研究。

E-cad被認為是上皮癌侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制因子。在鱗狀細胞癌中，E-cad表達缺失是癌前病變進展到轉(zhuǎn)移浸潤的原因之一，并與轉(zhuǎn)移和預后相關(guān)[21-22]。So等[23]發(fā)現(xiàn)在人高分化漿液性卵巢癌中Sprouty 2與E-cad水平呈正相關(guān)，并檢測到Sprouty 2位點缺失，過表達Sprouty 2可通過抑制EGF誘導的E-cad下調(diào)而抑制卵巢癌細胞侵襲，揭示Sprouty 2在介導EGF對人卵巢癌進展的刺激作用中發(fā)揮了重要的腫瘤抑制作用。本研究中E-cad在CSCC皮損中表達下調(diào)，與Sprouty 2表達呈正相關(guān)，與以上研究結(jié)果相符。Brouxhon等[24]研究發(fā)現(xiàn)紫外線引起的E-cad丟失與CSCC關(guān)系密切，E-cad細胞外結(jié)構(gòu)域片段可與RTK相互作用，通過RTK磷酸化和MAPK/PI3K/AKT/mTOR途徑活化促進腫瘤增殖、遷移和侵襲，而Sprouty 2也可通過RTK通路參與腫瘤增殖、分化、遷移等活動，提示在CSCC中Sprouty 2與E-cad可能通過協(xié)同作用抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

Ki-67作為特殊的增殖細胞核抗原可間接反映腫瘤細胞的增殖。CSCC中Ki-67蛋白及mRNA水平均高于正常組織[25]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，Ki-67在CSCC皮損中表達量上調(diào)，與Sprouty 2表達呈負相關(guān)，提示Sprouty 2與Ki-67可能通過拮抗作用抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

綜上，本研究明確了Sprouty 2與CSCC的相關(guān)性，為今后以Sprouty 2作為CSCC生物學行為和治療有效性的生物學指標研究提供了實驗基礎(chǔ)和研究方向。但是，Sprouty 2在CSCC發(fā)病機制中的作用仍需要深入探索，Sprouty 2是否通過對RTK通路發(fā)揮抑制作用參與CSCC發(fā)病，有待通過細胞實驗和動物實驗進一步求證。