張嘉, 張凱云, 陳濤, 趙娟, 王紅梅, 薛迎芳, 張國惠

1.包頭市中心醫(yī)院，2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，包頭 內(nèi)蒙古 014040

銀屑病是環(huán)境和遺傳共同作用的非傳染性、慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為紅斑基礎(chǔ)上的鱗屑、斑片、斑塊皮損，病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞增殖加速，角化過度或角化不全[1]。銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖并且伴隨炎癥浸潤，可導(dǎo)致皮膚菌群失調(diào)及機(jī)體免疫耐受性下降，誘發(fā)銀屑病加重或發(fā)作[2]。部分銀屑病患者在皮損出現(xiàn)前有前驅(qū)的上呼吸道感染癥狀，同時(shí)在鼻咽處發(fā)現(xiàn)細(xì)菌與病毒的異常分布[3-4]，提示銀屑病發(fā)病可能與微生物菌群失調(diào)有關(guān)。隨著基因組學(xué)理論與技術(shù)的高速發(fā)展，16S rDNA測(cè)序技術(shù)已成熟運(yùn)用于銀屑病患者微生物菌群結(jié)構(gòu)分析中[5]，銀屑病患者腸道菌群已被證實(shí)出現(xiàn)明顯的微生物菌群失調(diào)[6]。

為進(jìn)一步探究銀屑病發(fā)病與皮膚表面微生物菌落失調(diào)之間是否具有直接或間接的關(guān)系，本研究采用16S rDNA測(cè)序技術(shù)分析初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病患者皮損表面菌群結(jié)構(gòu)，探究銀屑病患者皮損表面菌群組成與銀屑病發(fā)病的相關(guān)性，明確上呼吸道感染是否能夠影響點(diǎn)滴型銀屑病患者皮損表面微生物的結(jié)構(gòu),希望通過探究銀屑病發(fā)病與皮膚表面微生物菌落失調(diào)之間的關(guān)系，形成以微生物穩(wěn)態(tài)糾正為靶點(diǎn)的治療方向。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

納入2020年12月至2021年6月于包頭市中心醫(yī)院皮膚科就診的初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病的患者18例，點(diǎn)滴型銀屑病確診標(biāo)準(zhǔn)：① 臨床表現(xiàn)：浸潤性粟米至蠶豆大、表面附有白色鱗屑的丘疹、斑丘疹，散在或密集分布， Auspitz征陽性。② 皮膚鏡下出現(xiàn)銀屑病特征性表現(xiàn)(亮紅色背景，點(diǎn)狀血管或小球狀血管，血管一致性分布，可見白色鱗屑，出現(xiàn)環(huán)狀血管或者發(fā)夾樣血管為特異診斷)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次發(fā)病且診斷為點(diǎn)滴型銀屑病的患者；②年齡5～65歲;③近2個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用任何抗生素、免疫抑制藥物和糖皮質(zhì)激素者，1 周內(nèi)未外用抗生素;④24 h 內(nèi)未沖澡或搓澡；⑤否認(rèn)其他器質(zhì)性疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 患有其它皮膚性疾病、近期有皮膚創(chuàng)傷或感染未愈者;② 患有糖尿病、肝病、腎病等其他可能導(dǎo)致皮膚表面微生物菌群改變者。將18例銀屑病患者按照是否伴隨上呼吸道感染分為上呼吸道感染實(shí)驗(yàn)組(銀屑病上感組，9例)、非上呼吸道感染實(shí)驗(yàn)組(銀屑病非上感組，9例)。對(duì)照組選取同年齡段9例健康人。三組年齡(F=0.13,P=0.876)、性別(F=0.14,P=0.872),銀屑病上感組與非上感組病程(t=0.88,P=0.391)比較，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，具有可比性。患者均簽署知情同意書，研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過。

表1 三組一般資料Table 1 Characteristics of the three groups

1.2 主要試劑

DNA抽提試劑盒(Thermo Scientific)，Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs)，Gene JET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 用無菌水潤濕無菌棉簽，加壓順時(shí)針方向擦拭軀干、四肢紅色皮疹處，每次擦拭時(shí)間不小于30 s，擦拭后將無菌棉簽放入無菌離心管中，將離心管置于-20 ℃冰箱中保存。對(duì)照組取材部位及方法與患者組一致。

1.3.2 樣本DNA的提取 采用CTAB法提取皮膚表面微生物DNA，在360 nm 紫外燈下觀察電泳條帶情況，檢測(cè)所提取DNA的純度和濃度。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增和純化 取適量的上述基因組DNA樣品于離心管中，加入無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。選擇16S V4 區(qū)進(jìn)行測(cè)序，引物為515F-806R，515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；PCR 反應(yīng)體系30 μL：Phusion Master Mix(2×) 15 μL，Primer(2 μM) 3 μL(6 μM)，gDNA(1 ng/μL) 10 μL(5-10 ng)，H2O 2 μL；反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃，10 s,50 ℃，30 s,72 ℃，30 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。使用2%瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列，使用Thermo Scientific公司Gene JET膠回收試劑盒，處理目標(biāo)條帶，收集PCR 產(chǎn)物。

1.3.4 文庫構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序 使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行構(gòu)建，采用Qubit進(jìn)行定量和文庫檢測(cè)，文庫檢測(cè)合格后，使用NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將有效序列按照97%相似性進(jìn)行Operational Taxonomic Unit聚類[7]，組內(nèi)物種差異采用α多樣性分析[8]，組間物種差異采用β多樣性分析[9]，組間具體物種分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OTU 聚類分析

將有效序列進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)本次實(shí)驗(yàn)OTU聚類結(jié)果共有6 596條，其中門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)、種(Species)分別發(fā)現(xiàn)80、145、314、502、 1 192、672種。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果制作韋恩圖,可見三組樣本中含有相同物種，也含有該組的特有物種(圖1)。

圖1 維恩圖

繪制初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病上感組、非上感組、正常人群對(duì)照組三組在門水平物種相對(duì)豐度柱形圖(圖2)，可見優(yōu)勢(shì)物種為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)，上述三組的前三優(yōu)勢(shì)物種豐度分別為厚壁菌門 19.65%、32.68%、20.29%;變形菌門分別為46.13%、32.39%、39.14%;放線菌門分別為26.31%、26.10%、32.67%，三組間優(yōu)勢(shì)門物種豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(厚壁菌門、變形菌門、放線菌門P值分別為0.056、0.065、0.320)。由三組間在屬水平物種相對(duì)豐度柱形圖(圖3)可見，細(xì)菌豐度由高到低的前9名分別為棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、葡萄球菌(Staphylococcus)、Allorhizobium-neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、微球菌屬(Micrococcus)、棲水菌屬(Enhydrobacter)、丙酸桿菌屬(Cutibacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus),而鏈球菌屬(Streptococcus)排第12位。

圖2 門水平上物種相對(duì)豐度柱形圖

圖3 屬水平上物種相對(duì)豐度柱形圖

2.2 屬水平豐度聚類

根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取了豐度排名前35的屬，繪制成熱圖(圖4)。橫向觀察該圖，初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病上感組優(yōu)勢(shì)物種為假單胞菌屬、棲水菌屬、考克氏菌屬(Kocuria)、異常球菌屬(Deinococcus)、芬戈?duì)柕戮鷮?Finegoldia)；初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病非上感組優(yōu)勢(shì)物種為嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、Turicibacter、芽孢桿菌屬(Bacillus)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、微球菌屬、副球菌屬(Paracoccus)、Sandaracinobacterium、Jeotgalicoccus。縱向觀察該圖可見，每個(gè)樣本在屬水平優(yōu)勢(shì)物種的相對(duì)豐度大小均不同。

圖4 物種豐度聚類熱圖

2.3 α多樣性分析

采用Alpha Diversity進(jìn)行組內(nèi)樣本物種多樣性進(jìn)行分析。稀釋曲線檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)據(jù)是否合理(圖5)，根據(jù)已抽取的測(cè)序數(shù)據(jù)量與對(duì)應(yīng)的指數(shù)值構(gòu)建曲線(cutoff=59852)，隨著隨機(jī)提取測(cè)序數(shù)據(jù)的增加，后端曲線趨于平坦，本次實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)據(jù)合理。使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，包含Observed-species、Chao1、

圖5 樣本稀釋性曲線

Shannon、Simpson、ACE和Goods-coverage指數(shù)。單因素方差分析3組間 α 多樣性，各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (表2)。

2.4 Beta多樣性分析

采用Beta多樣性比較三組間微生物群落構(gòu)成，評(píng)估微生物群落間的差異。通過wilcox 秩和檢驗(yàn)分析三組組間物種Beta多樣性差異，箱形圖(圖6)展示如下，對(duì)照組與銀屑病上感組(P=0.003)、非上感組(P<0.05)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而銀屑病上感組與非上感組間無明顯差異(P=0.062)。

表2 α 多樣性指數(shù)的比較Table 2 Comparison of alpha diversity index

圖6 基于Unweighted Unifrac的 Beta多樣性箱形圖

考慮到皮膚表面微生物菌落結(jié)構(gòu)為生態(tài)結(jié)構(gòu)，采用無度量多維標(biāo)定法(non-metric multi-

圖7 基于Unweighted Unifrac的 NMDS分析

dimensional scaling,NMDS)對(duì)三組間物種組成進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析(圖7)。結(jié)果顯示，正常組實(shí)驗(yàn)樣本較為聚類集中，銀屑病非上感組和上感組實(shí)驗(yàn)樣本較為分散，且聚集區(qū)域不同，說明正常組微生物菌落結(jié)構(gòu)不同于初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病組。

2.5 組間差異性物種分析

正常組與銀屑病非上感組對(duì)比，在門水平，正常組Campylobacterota門豐度較高；在綱水平，正常組γ-變形菌綱豐度較高，在屬水平，正常組的丙酸桿菌屬、勞森菌屬(Lawsonella)、放線菌屬(Actinomyces)、Auricoccus-Abyssicoccus豐度較高。正常組與銀屑病上感組對(duì)比，在屬水平，正常組勞森菌屬豐度較高，銀屑病上感組未明確定義周蝶菌屬(unidentifiedWeeksellaceae)豐度較高；銀屑病上感組與非上感組對(duì)比，在綱水平，銀屑病上感組γ-變形菌綱豐度較高；在目水平，銀屑病上感組假單胞菌目(Pseudomonadales)豐度較高；在屬水平，銀屑病上感組棲水菌屬、假單胞菌屬豐度較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.05，表3)。

2.6 組間LEfSe分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證組間物種差異性，采用LEfSe(LDA Effect Size)分析銀屑病上感組、非上感組和正常組三組間物種豐度數(shù)據(jù)，尋找組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。將LDA閾值設(shè)置為4，發(fā)現(xiàn)LDA數(shù)值大于4的Biomarker有11個(gè)，初發(fā)急性點(diǎn)滴型銀屑病上感組與其他組對(duì)比具有極其顯著差異的物種為Gammaproteobacteria、Pseudomonadales、Enhydrobacter、Rhizobiales、Pseudomonadaceae、Pseudomonas；正常組與其他組對(duì)比具有極其顯著差異的物種為Dermabacteraceae、Brachybacterium、Propionibacteriaceae、Cutibacterium、Propionibacteriales；銀屑病上感組中未發(fā)現(xiàn)極其顯著差異的物種。LDA值分布柱狀圖見圖8，進(jìn)化分支圖見圖9。

表3 三組間皮膚表面微生物的豐度 (mean±SD)Table 3 The abundance of microorganisms on skin surface among three groups (mean±SD)

圖8 LDA值分布柱狀圖

圖9 進(jìn)化分支圖

3 討論

在銀屑病患者皮損表面微生物菌群分析中，Gao等[10]發(fā)現(xiàn)在門水平銀屑病患者皮膚放線菌門和變形菌門豐度下降，厚壁菌門豐度增加，在屬水平，鏈球菌屬和葡萄球菌屬豐度增加；而另有研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病患者皮損中放線菌門、變形菌門豐度增加[11]，研究結(jié)果的不同可能與取材方法不同相關(guān)。

本研究采用16S rDNA 測(cè)序初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病患者與健康人群皮膚表面微生物，發(fā)現(xiàn)正常組人群皮膚痤瘡桿菌屬豐度明顯高于銀屑病非上感組，與Fyhrquist[12]、Langan等[13]研究結(jié)果相似。丙酸痤瘡桿菌在銀屑病患者皮損表面的減少可能與抓撓皮膚相關(guān)，搔抓皮膚可破壞皮膚屏障，使病原菌進(jìn)入皮膚。在真皮深層甚至外周血液中都會(huì)發(fā)現(xiàn)一些表皮定植的細(xì)菌，它們與免疫細(xì)胞接觸，引起先天性和獲得性炎癥[14]。丙酸痤瘡桿菌是一種保護(hù)性共生菌，是皮膚微生物的重要組成部分，在皮膚動(dòng)態(tài)平衡中起著重要作用，是人類皮膚微生物群的哨兵[15]。在皮膚免疫中，丙酸痤瘡桿菌可以調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答[16]，促進(jìn)體內(nèi)輔助性T細(xì)胞1型(Th1)細(xì)胞的激活[17]，清除細(xì)胞內(nèi)病原體，發(fā)揮丙酸痤瘡桿菌競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，抑制致病微生物的定植，從而起到保護(hù)皮膚作用。有研究在IB型和Ⅲ型丙酸痤瘡桿菌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能夠產(chǎn)生抗菌肽的基因簇[18]，抗菌肽的出現(xiàn)可從一定程度上抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，起到皮膚屏障作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病非上感組放線菌屬和勞森氏菌屬豐度比正常人群低，而Weeksellaceae屬豐度較高，具體機(jī)制不明，上述菌屬與銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究目前停留在菌群差異方面[19-20]。 本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬在各組之間的差異性，但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)化膿性鏈球菌可通過超抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化參與銀屑病發(fā)病，真皮層中的鏈球菌超抗原直接與人類白細(xì)胞抗原、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞上的DR同種型分子(HLA-DR)結(jié)合，導(dǎo)致白介素-1和腫瘤壞死因子-α釋放，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，這可能引發(fā)或加劇銀屑病炎癥[21]。化膿性鏈球菌還可通過皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原陽性T細(xì)胞與表皮細(xì)胞的相互作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-9、IL-17A和IFN-γ，參與銀屑病發(fā)病過程[22]，推測(cè)這一差異性結(jié)論的出現(xiàn)可能與取材部位不同相關(guān)。

除上述細(xì)菌外，皮膚表面真菌的異常分布也可能參與銀屑病的發(fā)病過程，馬拉色菌是人體皮膚表面常見的一種真菌，可通過調(diào)控細(xì)胞因子的釋放參與銀屑病的發(fā)病過程，馬拉色菌通過Toll樣受體2途徑觸發(fā)細(xì)胞因子IL-8的釋放[23]，IL-8可上調(diào)角質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、熱休克蛋白70和整聯(lián)蛋白的表達(dá)[24]，同時(shí)激活補(bǔ)體并募集中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向真皮遷移[25]，從而導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖，加速銀屑病發(fā)病進(jìn)程。馬拉色菌可下調(diào)Th2細(xì)胞誘導(dǎo)的IL-4、IL-10及IL-13等細(xì)胞因子，參與銀屑病的發(fā)病機(jī)制[26]。

本研究將初發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病分為上呼吸道感染組和非上呼吸道感染組進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，上呼吸道感染組棲水菌屬、假單胞菌屬豐度都較高，這兩個(gè)菌屬都屬于γ-變形菌綱，與Wang等[27]研究結(jié)果相似。提示在后續(xù)的銀屑病皮損微生物研究中應(yīng)該將銀屑病患者是否具有上呼吸道感染癥狀納入實(shí)驗(yàn)因素，將具有上呼吸道感染癥狀和不具有上呼吸道感染癥狀的患者分開比較，可能更具科學(xué)性。

綜上所述，銀屑病患者皮損表面微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化，但具體原因不明，需進(jìn)一步研究銀屑病患者皮損表面微生物菌群穩(wěn)態(tài)變化，了解皮膚菌群失調(diào)是否為誘發(fā)或加重銀屑病發(fā)病的因素。在探討銀屑病發(fā)病機(jī)制的過程中，通過調(diào)整銀屑病患者皮損表面微生物菌群穩(wěn)態(tài)，可為銀屑病的治療帶來新的診療思路。