張 薇 任春平 張文莉

[寧夏中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（寧夏第三人民醫(yī)院）檢驗(yàn)科，寧夏 銀川，750021]

由于臨床肺炎患者增加，準(zhǔn)確快速檢出肺炎患者的病原菌對(duì)臨床的診治至關(guān)重要。重癥肺炎是臨床上常見(jiàn)的危重疾病，其病情發(fā)展迅速，常出現(xiàn)休克及多個(gè)器官功能障礙，病死率高且預(yù)后差[1]。傳統(tǒng)病原學(xué)檢查主要包括痰涂片、痰培養(yǎng)和血清學(xué)檢查[2-3]。其中痰培養(yǎng)是臨床最常用的細(xì)菌檢測(cè)手段，但培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率僅為45%～55%[4]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，以特異性強(qiáng)、敏感度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診斷。研究顯示，LAMP技術(shù)可以快速擴(kuò)增肺部感染患者痰液中的常見(jiàn)致病菌核酸，以細(xì)菌濃度1×103為界值，敏感度達(dá)74.0%，特異度達(dá)95.3%[5-6]。呼吸道病原菌核酸檢測(cè)（恒溫?cái)U(kuò)增芯片法）在LAMP技術(shù)的研究基礎(chǔ)上，采用微流控芯片技術(shù)和恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，摻入熒光染料進(jìn)行恒溫（65 ℃）反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光分析，一步完成對(duì)靶基因的擴(kuò)增和檢測(cè)，可以同時(shí)檢測(cè)13項(xiàng)主要病原菌[7]。但對(duì)于重癥肺炎患者檢測(cè)結(jié)果與痰培養(yǎng)的對(duì)照研究及影響因素分析，國(guó)內(nèi)鮮有研究報(bào)道[8]。本研究通過(guò)觀察給予重癥肺炎患者LAMP技術(shù)檢測(cè)和傳統(tǒng)痰培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，旨在深入探討LAMP技術(shù)對(duì)早期重癥肺炎的臨床診斷價(jià)值和意義，為規(guī)范重癥肺炎患者早期臨床病原微生物檢測(cè)奠定理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年4月～2022年4月寧夏中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的重癥肺炎患者100例作為研究對(duì)象。所有患者均知情同意參與本研究并簽署知情同意書(shū)，且本研究已被寧夏中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，即滿(mǎn)足1項(xiàng)主要標(biāo)準(zhǔn)或≥3項(xiàng)次要標(biāo)準(zhǔn)[9]。主要標(biāo)準(zhǔn)：①氣管插管需要機(jī)械通氣；②感染性休克積極體液復(fù)蘇后仍需要血管活性藥物。次要標(biāo)準(zhǔn)：①呼吸頻率>30次/min；②氧合指數(shù)<250 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa）；③多肺葉浸潤(rùn)；④意識(shí)障礙和（或）定向障礙；⑤血尿素氮≥7 mmol/L；⑥低血壓需要積極的液體復(fù)蘇。（2）年齡18～90歲。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①艾滋病毒感染者；②肺結(jié)核者；③痰液標(biāo)本采集不合格者；④自動(dòng)出院或死亡者；⑤合并腫瘤患者；⑥妊娠、哺乳期婦女；⑦神經(jīng)精神障礙者。

1.3 檢測(cè)方法

所有患者入院后規(guī)范化留取痰標(biāo)本（晨起漱口后留取深咳痰約3～5 mL）立即送檢到微生物室，都給予LAMP技術(shù)和傳統(tǒng)痰培養(yǎng)檢測(cè)。檢測(cè)設(shè)備：API鑒定板條購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，恒溫?zé)晒夂怂釘U(kuò)增儀購(gòu)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社，核酸提取與純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，抗酸染色液購(gòu)自瑞羅氏公司，BSC-ⅡB2生物安全柜購(gòu)自國(guó)藥北京公司。

1.3.1 傳統(tǒng)痰培養(yǎng)檢測(cè)

將采集的痰標(biāo)本在2 h內(nèi)分別接種于血平板、巧克力平板、伊紅美藍(lán)平板上，置于35 ℃恒溫箱中孵育24～48 h，用API鑒定板條或VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀進(jìn)行鑒定。

1.3.2 LAMP技術(shù)檢測(cè)

采集的痰標(biāo)本按以下流程處理：①樣本處理：根據(jù)標(biāo)本性狀加入不同比例10%氫氧化鈉溶液（NaOH），充分震蕩混勻，于37 ℃液化30 min，以無(wú)固態(tài)及拉絲狀為液化完全；取1 mL液化樣本于1.5 mL無(wú)菌離心管中，12 000 r/min，離心5 min，棄上清液；加入1 mL洗液，震蕩使沉淀完全懸浮，重復(fù)離心，棄上清液。②核酸提?。合蛩占w中加入50～100 μL核酸提取液，振蕩使沉淀完全懸浮，轉(zhuǎn)移至核酸提取管中，劇烈振蕩5 min，95 ℃加熱5 min，10 000 r/min，離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至潔凈離心管中，取得的核酸直接進(jìn)行檢測(cè)。③芯片加樣：按照操作說(shuō)明，取出恒溫?cái)U(kuò)增試劑，室溫解凍，瞬時(shí)離心至管底，吸取20 μL恒溫?cái)U(kuò)增試劑加入準(zhǔn)備好的200 μL離心管中，加入34.5 μL被檢核酸樣品，輕搖使其充分混合均勻，瞬時(shí)離心至管底，反應(yīng)體系54.5 μL；在潔凈工作臺(tái)內(nèi)取出芯片恢復(fù)至室溫，吸取50 μL上述配制好的核酸擴(kuò)增體系，從進(jìn)出樣口1加入到芯片主通道中，待其充滿(mǎn)芯片主通道即停止加樣；取1張封口膜，覆蓋于進(jìn)出樣口上，按壓至貼合緊密，固定后上機(jī)。

1.4 觀察指標(biāo)

①調(diào)查與記錄所有患者的一般資料，包括性別、年齡、病程、體質(zhì)量指數(shù)。②對(duì)所有患者的病原體檢出情況進(jìn)行分組，其中單一病原體感染作為單一組，包括肺炎支原體、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌等，合并感染的作為合并組。③以傳統(tǒng)痰培養(yǎng)檢查作為判斷的金標(biāo)準(zhǔn)，判斷LAMP技術(shù)在重癥肺炎患者病原體的診斷價(jià)值。特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽(yáng)性）例數(shù)×100%，敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性+假陰性）例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料對(duì)比

在100例患者中，傳統(tǒng)痰培養(yǎng)判斷為單一病原體感染65例，合并病原體感染35例。合并組的性別、年齡、病程、體質(zhì)量指數(shù)等與單一組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料對(duì)比 [（±s）/n]

組別 例數(shù) 性別（男/女）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）合并組 35 18/17 50.67±3.28 11.69±0.24 21.73±1.11單一組 65 33/32 50.98±2.48 11.87±0.83 21.78±0.98 t/χ2 0.004 0.314 0.224 0.087 P 0.950 0.714 0.801 0.934年齡（歲）病程（d）

2.2 LAMP技術(shù)檢測(cè)情況

在100例患者中，LAMP技術(shù)平均檢測(cè)時(shí)間為（2.10±0.02）h，LAMP技術(shù)檢出肺炎鏈球菌21例，金黃色葡萄球菌11例，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌18例，大腸埃希菌15例，銅綠假單胞菌14例，鮑曼不動(dòng)桿菌22例，肺炎克雷伯菌10例，嗜麥芽窄食單胞菌9例，其他22例。傳統(tǒng)痰培養(yǎng)判斷為單一病原體感染65例，合并病原體感染35例，檢出肺炎鏈球菌22例，金黃色葡萄球菌10例，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌17例，大腸埃希菌14例，銅綠假單胞菌13例，鮑曼不動(dòng)桿菌22例，肺炎克雷伯菌10例，嗜麥芽窄食單胞菌8例。LAMP技術(shù)判斷為單一病原體感染62例，合并病原體感染38例，LAMP技術(shù)診斷的敏感性與特異性分別為100.00%（35/35）和95.38%（62/65）。見(jiàn)表2。

表2 LAMP技術(shù)在重癥肺炎患者病原體感染的診斷敏感性與特異性

3 討論

近年來(lái)，重癥肺炎病死率逐年升高，有文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)重癥肺炎的病死率達(dá)50%[10]。臨床上對(duì)肺炎的診斷主要依據(jù)影像學(xué)檢測(cè)，但影像學(xué)檢測(cè)的敏感度及特異性并不是100%，且部分患者會(huì)錯(cuò)過(guò)檢查[11]。重癥肺炎患者在臨床指征、抗感染方面不同于普通社區(qū)獲得性肺炎患者，治療過(guò)程非常復(fù)雜，如能在疾病早期給予治療，可降低病死率[12]。因此，確定重癥肺炎患者感染的病原體至關(guān)重要。本研究顯示，在100例患者中，傳統(tǒng)痰培養(yǎng)判斷為單一病原體感染65例，合并病原體感染35例。

傳統(tǒng)病原學(xué)檢查主要包括痰涂片、痰培養(yǎng)和血清學(xué)檢查等，但存在以下缺陷：①痰涂片靈敏度低，只能初步識(shí)別革蘭氏染色陰、陽(yáng)性菌，了解細(xì)菌大致形態(tài)，不能明確具體病原菌；②痰培養(yǎng)是臨床最常用的細(xì)菌檢測(cè)手段，但培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率僅為45%～55%；③血清抗原抗體檢測(cè)有滯后性，患者臨床癥狀已好轉(zhuǎn)，抗體檢測(cè)仍可呈陽(yáng)性[13]。

涂片抗酸染色法雖然具有經(jīng)濟(jì)要求不高、操作簡(jiǎn)單、快速得出結(jié)果等特點(diǎn)，但是檢出限比較高，只有當(dāng)痰標(biāo)本中的細(xì)菌含量達(dá)到10 000條/mL左右時(shí)，才能被涂片抗酸染色法檢出，檢測(cè)的靈敏性有待提高。作為一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，LAMP技術(shù)對(duì)于痰液標(biāo)本中目的細(xì)菌的陽(yáng)性檢出率明顯高于涂片抗酸染色法。特別是LAMP反應(yīng)在合成DNA的過(guò)程中會(huì)釋放出副產(chǎn)物，如偶?xì)潆x子、焦磷酸根離子，因此反應(yīng)液的pH值會(huì)隨著反應(yīng)的過(guò)程而發(fā)生一定的變化。如果產(chǎn)物由初始?jí)A性變?yōu)樗嵝裕墒褂胮H敏感指示劑作為染料檢測(cè)DNA擴(kuò)增，有利于肉眼區(qū)分陽(yáng)性與陰性，提高LAMP技術(shù)應(yīng)用的靈敏性。LAMP技術(shù)與PCR技術(shù)相似，可針對(duì)目標(biāo)基因DNA或cDNA在不同區(qū)域設(shè)計(jì)多條引物，利用恒溫聚合酶進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間比較短，直接通過(guò)溶解曲線、擴(kuò)增曲線即可判斷結(jié)果[14-15]。LAMP技術(shù)可檢測(cè)13種病原體，包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等，能有效區(qū)分同一病原菌的各種亞型，也能鑒別不同類(lèi)型的病原菌，具有高度診斷特異性，也具有快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)[16-17]。本研究在100例患者中，LAMP技術(shù)平均檢測(cè)時(shí)間為（2.10±0.02）h，檢出肺炎鏈球菌21例，金黃色葡萄球菌11例，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌18例，大腸埃希菌15例，銅綠假單胞菌14例，鮑曼不動(dòng)桿菌22例，肺炎克雷伯菌10例，嗜麥芽窄食單胞菌9例，其他22例。LAMP技術(shù)判斷為單一病原體感染62例，合并病原體感染38例，LAMP技術(shù)診斷的敏感性與特異性分別為100.00%和95.38%，也說(shuō)明LAMP技術(shù)在重癥肺炎患者病原體檢測(cè)中具有重要的價(jià)值。從機(jī)制上分析，LAMP技術(shù)核酸的擴(kuò)增效率極高，1 h內(nèi)產(chǎn)物可達(dá)靶基因的109～1010倍，不需要復(fù)雜的溫控設(shè)備，對(duì)環(huán)境要求相對(duì)較低[18]。不過(guò)在具體檢測(cè)過(guò)程中，要采集合格標(biāo)本，用可控式負(fù)壓吸痰管收集痰標(biāo)本，并立即送檢，采集要求涂片顯示白細(xì)胞>25/LP，上皮細(xì)胞<10/LP，痰液量至少0.6 mL。LAMP技術(shù)在檢測(cè)中每張芯片均設(shè)有1個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控，9個(gè)陰性質(zhì)控，若任一結(jié)果錯(cuò)誤則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，需進(jìn)行復(fù)檢[19]。試劑盒有陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，以質(zhì)控實(shí)驗(yàn)環(huán)境和人員操作，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[20]。同時(shí)由于經(jīng)費(fèi)問(wèn)題，本研究設(shè)置的組別比較少，沒(méi)有對(duì)具體某個(gè)病原體進(jìn)行對(duì)比分析，將在后續(xù)研究中探討。

綜上所述，重癥肺炎患者多伴隨有病原體感染情況，LAMP技術(shù)能準(zhǔn)確快速檢出重癥肺炎患者病原體感染情況，具有時(shí)間短、特異性高等優(yōu)勢(shì)，有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。