央金拉姆 尼珍

（西藏自治區(qū)高原生物研究所，西藏 拉薩 850000）

船盔烏頭(Aconitum naviculare(Bruhl.)Stapf）又名船形烏頭、其藏藥名為“榜嘎”，屬于毛茛科烏頭屬的矮小草本植物，塊根小，胡蘿卜形，莖高10～45 厘米，下部無毛，上部疏被反曲并貼伏的短柔毛。基葉及下部莖生葉具長柄；葉片半圓狀五角形或腎形，長1～2厘米，寬1.4～3 厘米，基部心形或截形，3 裂近中部，表面疏被短柔毛，背面無毛，葉柄長2.5～14 厘米，無毛。莖生葉1～3，漸變小?？偁罨ㄐ蚓?～4 花；軸及花梗被反曲的短柔毛；花梗長達6厘米；小苞片生花梗莖頂部處，線形，長6～7 毫米；萼片堇色，外面疏被短柔毛，上萼片船形，自基部至喙長約1.6 厘米，側(cè)萼片寬倒卵形，長約1.6 厘米；花瓣無毛，瓣片長約2.5 毫米，唇長約1.5 毫米，距長約1 毫米，向外彎；心皮5，子房疏被短柔毛。9月開花。性味苦，寒，有小毒。生于高山碎石縫隙和高山草甸，灌叢中、或河灘上，海拔4100～5000 米。產(chǎn)于拉薩、朗縣、加查、乃東（澤當）、墨竹工卡（格桑）、錯那、亞東（帕里）。其塊根狀如小象犬牙，葉翠綠，螺狀，有清熱解毒利濕的功效，能治胃炎、肝炎、腎炎、腸炎。［1］

《概念釋詮》中說：“榜嘎生長在陰涼的石山坡，螺形根如象牙，葉如玉葉，螺狀花很美麗，為解毒清膽熱之后藥。”《圖鑒》中說：“榜嘎分白、黑、紅、黃四種，白、紅、黃三種是藥，黑烏頭有毒亦可入藥?！睋?jù)《晶珠本草》記載“船盔烏頭味苦，性涼。清熱解毒。治瘟病時疫、赤巴病、傳染病發(fā)燒、肝膽熱病，特別是膽熱病和宿熱病療效尤佳，食物中毒、胃炎、肝炎。外用洗蛇、蝎咬傷。其主要化學(xué)成分有二萜生物堿，經(jīng)鑒定有C20二萜生物堿阿替辛及C19內(nèi)酯型二萜生物堿雜阿替辛及苯甲酰雜阿替辛。船盔烏頭中含有的生物堿阿替辛對貓、兔及狗具有降壓作用，小劑量能加強腎上腺素的升壓作用但減少心動徐緩。異阿替辛則有降壓及阻礙呼吸的作用，并能對抗由于烏頭堿或氯化鈣所導(dǎo)致的心律不齊的作用。船盔頭的塊根對小鼠的LD50（靜注）為2.374mg/kg，而船盔烏頭中所含主要生物堿之一雜阿替辛對小鼠LD50(靜注)為180～190g/kg，因而船盔烏頭在烏頭類中屬于毒性較低的一類?！?/p>

2015 年由西藏自治區(qū)科技廳組織的根據(jù)我區(qū)藏醫(yī)藥專家、植物學(xué)家、各企業(yè)等對我區(qū)瀕危藏藥材品種的選定進行收集和整理后，評選出西藏瀕危藏藥材品種，劃分為三個保護等級，其中，船盔烏頭列入一級瀕危名錄。

1 船盔烏頭組培快繁技術(shù)研究背景

組培快繁技術(shù)是根據(jù)細胞的全能性理論，也稱離體培養(yǎng)，是指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在無菌條件下接種至含有各種營養(yǎng)物質(zhì)及植物激素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，來獲得再生的完整植株技術(shù)。有研究表明，西藏地區(qū)藏藥“榜嘎”的實際基原是船盔烏頭的干燥全草或地上部分，據(jù)自治區(qū)藏藥廠提供的資料，約30%的藏藥組方中都有船盔烏頭的組分，安兒寧顆粒、大月晶丸、坐珠達西、流感丸、十三味榜嘎丸、十二味奇效湯散、八味獐牙菜、二十五味松石丸和亞瑪眾清制劑等藏藥當中都含有船盔烏頭。［2］目前船盔烏頭的供給主要是靠野生資源，但是市場上對船盔烏頭的需求量日不斷增多，但自然狀態(tài)下船盔烏頭分布零星，單株產(chǎn)量低下，自然生長趕不上人為采集，采集量的增大不僅破壞種群的自然更新，也破壞了船盔烏頭的生境，使得船盔烏頭的資源趨于瀕危狀態(tài)，已經(jīng)在一定程度上影響到藏醫(yī)藥事業(yè)的健康發(fā)展。因此,研究船盔烏頭的組培快繁技術(shù)迫在眉睫。［3］

2 船盔烏頭組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀

目前，有關(guān)一級瀕危藏藥植物船盔烏頭的研究，涉及資源與使用情況、種子萌發(fā)特性研究、染色體數(shù)目和核型分析、化學(xué)成分分離及其薄層色譜定性鑒別研究、生物堿成分分離及質(zhì)量標準研究、總生物堿的抗炎作用等領(lǐng)域，但涉及本研究特點的一級瀕危藏藥植物船盔烏頭的組織培養(yǎng)快速繁殖研究尚屬空白，因此，通過本研究進行一級藏藥植物船盔烏頭的快速繁殖研究，從而能夠緩解船盔烏頭野生資源匱乏、用藥資源緊缺的壓力。

3 無菌苗的獲取

3.1 外植體的選取和處理

本實驗選擇2019 年拉薩周邊采集的船盔烏頭植株作為實驗材料，分別用船盔烏頭的種子、船盔烏頭的根、船盔烏頭的莖段和船盔烏頭的葉片四種組織作為外植體。

外植體材料的消毒滅菌處理，是植物組培實驗過程中的關(guān)鍵一步，影響愈傷組織的褐化率或誘導(dǎo)率，進而影響組培苗的存活率。

船盔烏頭干種子黑褐色，呈“扁金字塔”形，長1.5～2.2mm，寬0.6～1.1mm，厚可達0.8mm。種子表面不光滑，皺縮，種脊邊緣延生成翅狀。船盔烏頭種子千粒重為（0.495±0.003）g，屬于極小粒種子。首先用肥皂水將種子清洗干凈，后用酒精對種子進行消毒，最后在超凈工作臺上以0.1% HgCL 溶液設(shè)置消毒處理時間梯度，再用無菌水清洗4～5 次，瀝干水分備用。

船盔烏頭的葉片腎狀五角形或腎形，長1～2 厘米，寬1.4～3厘米，三裂近中部，中央裂片菱狀倒梯形，側(cè)裂片斜扇形，不等二裂近中部，表面疏被短柔毛，背面無毛；葉柄長2.5～14 厘米，無毛，基部具不明顯的鞘。莖生葉1～3 枚，稀疏排列，具較短柄。選擇較嫩的葉片，剪成兩片，先用水清洗干凈，再用酒精進行消毒，后用0.1% HgCL 溶液設(shè)置消毒處理時間梯度，再用無菌水清洗4～5 次，瀝干水分。

船盔烏頭的莖段下部無毛，上部疏被反曲而緊貼的短柔毛，呈圓柱形空心，取嫩枝上的莖段，用肥皂水進行清洗，再用酒精進行消毒，以0.1% HgCL 溶液進行消毒處理，設(shè)置消毒處理時間梯度，再用無菌水清洗4～5次，瀝干水分備用。

3.2 外植體啟動培養(yǎng)

已經(jīng)消毒處理過的三種外植體（種子、莖段、葉片）在超凈工作臺上分別接種至初始培養(yǎng)基上，初始培養(yǎng)基為MS+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5g/L，PH 值5.8。培養(yǎng)基是植物組織快繁過程中最主要的部分，是植物組織生長發(fā)育的主要營養(yǎng)來源。接種后在智能人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)14d后，三種外植體中只有消毒時間為8 min 和10 min的種子開始發(fā)芽，再移至培養(yǎng)室光照條件下培養(yǎng)20d，培養(yǎng)溫度為20±2℃。即可長出小苗，再培養(yǎng)20d 無菌小苗可長至約4cm 高，莖段和葉片作為外植體啟動培養(yǎng)都未發(fā)芽成功。此處，對三種外植體的消毒處理，都是用酒精和0.1% HgCL 進行消毒處理。

表1 0.1% HgCL不同處理時長萌發(fā)情況對比

4 分化及生根培養(yǎng)

4.1 船盔烏頭分化培養(yǎng)

分化培養(yǎng)是促進細胞發(fā)育成各自的組織。將初始培養(yǎng)得到的船盔烏頭無菌苗剪切成節(jié)段，分別接種到以下9種不同的培養(yǎng)基當中：

（1）1/2MS+6-BA10mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（2）1/2MS+6-BA15mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（3）1/2MS+6-BA20mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（4）1/2MS+IAA0.05mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（5）1/2MS+IAA0.1mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（6）1/2MS+IAA0.15mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（7）1/2MS+NAA0.05mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8;

（8）1/2MS+NAA0.1mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8。

（9）1/2MS+NAA0.15mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8。

在培養(yǎng)室的光照條件下培養(yǎng)至20d，能觀察到3號分化培養(yǎng)基里的船盔烏頭無菌苗存活率和長勢都優(yōu)于其余8種分化培養(yǎng)基。

表2 不同分化培養(yǎng)基對比

4.2 船盔烏頭生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程，這個過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。將分化培養(yǎng)得到的無菌苗分別接種到以下10種不同的培養(yǎng)基當中：

（1）MS+蔗糖30g/L+瓊脂粉5g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（2）1/2MS+6-BA5mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1 g/L，PH值5.8；

（3）1/2MS+6-BA7mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1 g/L，PH值5.8；

（4）1/2MS+6-BA9mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1 g/L，PH值5.8；

（5）1/2MS+NAA0.5mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（6）1/2MS+NAA1mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（7）1/2MS+NAA1.5mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（8）1/2MS+IAA0.5mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（9）1/2 MS+IAA1mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（10）1/2 MS+IAA1.5mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8。

接種時將帶腋芽節(jié)段斜插在培養(yǎng)基上，接種后放在人工智能培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱的環(huán)境設(shè)置模擬船盔烏頭的野外生長環(huán)境，即白天、夜晚兩個時段，白天12 小時，溫度20℃，光照強度1000～1500Lx；夜晚12 小時，溫度10℃，無光照，在此培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20d 左右可以發(fā)現(xiàn)有明顯的根部粗壯現(xiàn)象，相比之下10 種培養(yǎng)基當中1 號生根培養(yǎng)基和2 號生根培養(yǎng)基的長勢最好。

表3 不同生根培養(yǎng)基對比

5 結(jié)果與分析

5.1 本次船盔烏頭組織培養(yǎng)啟動實驗通過酒精和0.1%HgCL 對所選外植體進行消毒處理，利用初始培養(yǎng)基MS+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5g/L，PH值5.8，在人工氣候培養(yǎng)箱里進行暗培養(yǎng)，結(jié)果只有種子作為外植體時萌發(fā)成功，莖段和葉片作為外植體進行啟動試驗時并未成功萌發(fā)，因此，種子作為外植體比較方便消毒，成功獲得無菌苗。

5.2 船盔烏頭的組織培養(yǎng)分化培養(yǎng)過程中，通過添加不同濃度的細胞生長素和細胞分裂素的MS 培養(yǎng)基，研究對船盔烏頭初始無菌苗形成的影響，表明培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 20mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L,PH5.8適合于船盔烏頭初始無菌苗的分化。

5.3 船盔烏頭組織培養(yǎng)生根培養(yǎng)過程中，通過添加不同濃度的細胞生長素和細胞分裂素的MS 培養(yǎng)基，研究對船盔烏頭已經(jīng)分化的組培苗形成的影響，結(jié)果表明培養(yǎng)基MS+蔗糖30 g/L+瓊脂粉5g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH 值5.8 和1/2MS+6-BA 5mL/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1 g/L，PH值5.8，最適合船盔烏頭的生根培養(yǎng)。