張艷萍 鐘世林 薛利萍 鄧玉清

廣東省深圳市北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心 (廣東 深圳 518036)

出生缺陷是出生前發(fā)生的先天發(fā)育異常，是導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、嬰幼兒死亡及多種先天性疾病的主要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國每年出生的出生缺陷數(shù)量占新出生新生兒的4%-6%，因染色體異常導(dǎo)致的出生缺陷占0.6%[1]。Lo[2]等1997年首次從孕育男胎的孕婦血清和血漿中提取并檢測到了男性胎兒DNA，開創(chuàng)了NIPT產(chǎn)前檢測技術(shù)的新模式，檢測范圍也從最初的T13、T18、T21三種最常見的染色體疾病的檢測延伸至染色體微缺失微重復(fù)綜合征的檢測。本研究回顧性分析338例在北京大學(xué)深圳醫(yī)院NIPT結(jié)果異常進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦，對NIPT陽性結(jié)果與胎兒染色體核型和CMA檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，了解NIPT在臨床咨詢中對染色體異常的指導(dǎo)作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2018年3月至2019年12月期間在我院或外院檢查NIPT結(jié)果異常，經(jīng)產(chǎn)前診斷醫(yī)生遺傳咨詢后，進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷的338例孕婦，回顧性分析相關(guān)資料，孕婦年齡19～47歲，平均年齡30.45±4.85歲，孕周17周～25+6周，平均孕周19.89±2.42周，均為單胎妊娠。

1.2 方法

1.2.1NIPT NIPT的條件為：孕周為12-22+6周，近期未接受過細(xì)胞治療、免疫治療、異體輸血、移植手術(shù)，體重<100Kg，孕婦無染色體異常等。檢測機(jī)構(gòu)為深圳華大基因醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)室，通過各個(gè)染色體Z值檢測胎兒染色體非整倍體異常情況，正常參考值為-3.0～3.0，檢測結(jié)果在正常參考范圍內(nèi)結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)，Z>3.0，提示三體高風(fēng)險(xiǎn)，Z<-3，為單體高風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.2 介入性產(chǎn)前診斷 簽署手術(shù)知情同意書，術(shù)前一周無發(fā)熱、腹痛、陰道流血、感染等情況，完善血常規(guī)、感染指標(biāo)、凝血功能、胎兒超聲等，在我院產(chǎn)前診斷中心行超聲引導(dǎo)下羊水穿刺術(shù)或臍帶穿刺術(shù)。

1.2.3 染色體核型檢測方法 羊水細(xì)胞或臍血細(xì)胞在我院檢測，進(jìn)行培養(yǎng)及胎兒染色體G顯帶核型分析，染色體核型命名根據(jù)《人類遺傳學(xué)國際命名體制ISCN(2016)》。

1.2.4 CMA檢測機(jī)構(gòu)為廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢測，采用Affymetrix CytoScan芯片檢測，臨床意義分為多態(tài)、致病性、不明確、可能致病、可能良性5種。

1.3 隨訪產(chǎn)前診斷中心有專職人員負(fù)責(zé)電話詢問術(shù)后、引產(chǎn)后及分娩后新生兒情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)及率表示。

2 結(jié) 果

2.1 338例孕婦NIPT結(jié)果異常的孕婦，均行羊水穿刺，有1例孕婦因羊水結(jié)果異常，染色體核型結(jié)果45,X[9]/46,XY[91]，CMA提示7q21.11缺失357kb(可能良性)，于孕24周行臍帶穿刺，臍血染色體核型46，XN。338例孕婦有1例穿刺術(shù)后第2天流產(chǎn)，胎兒染色體核型47，XN,+21，CMA 提示染色體21q11.2～q22.3致病性重復(fù)33.08Mb；1例孕婦穿刺術(shù)后第4天胎膜破裂，住院引產(chǎn)，胎兒染色體核型45，X[73]/47，XXX[27]，CMA提示Xp22.33-q28嵌合缺失155.06Mb致病性。其余336例孕婦均未出現(xiàn)術(shù)后流產(chǎn)、宮內(nèi)感染、胎膜破裂等并發(fā)癥，穿刺流產(chǎn)率0.59%。

2.2 共檢出胎兒染色體核型異常177例，占52.37%，CMA異常202例，占59.76%，其中致病性異常166例，占49.11%，意義不明確36例，占10.65%，根據(jù)NIPT結(jié)果將其分為6種情況。

2.2.1 T21高風(fēng)險(xiǎn)病例 338例NIPT結(jié)果異常病例中，T21高風(fēng)險(xiǎn)78例，經(jīng)羊水穿刺確診染色體核型異常68例，占87.18%，10例正常，其中標(biāo)準(zhǔn)型21三體綜合征63例(47，XN,+21)，易位型2例[46,XN,der(14;21)(q10;q10)+21]，嵌合體型2例(47,XN,+21[54]/46.XN[46]；47.XN.+21[29]/46.XN[71])，13三體綜合征1例(47,XN,+13)。CMA檢測結(jié)果異常70例，其中68例與染色體核型診斷相符，1例提示17p12致病性缺失1.40Mb，1例意義不明確，該例17p12致病性缺失孕婦選擇繼續(xù)妊娠，隨訪期間孕晚期出現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長受限，孕37周因“胎兒窘迫”行剖宮產(chǎn)術(shù)，新生兒體重2.0kg，隨訪到目前該例寶寶除生長發(fā)育遲緩?fù)?，未發(fā)現(xiàn)其他異常。

2.2.2 T18高風(fēng)險(xiǎn)病例 338例NIPT結(jié)果異常病例中，T18高風(fēng)險(xiǎn)23例，經(jīng)羊水穿刺確診染色體核型異常15例，占65.22%，8例正常，均為18三體綜合征(47,XN,+18)，CMA異常16例，15例與染色體核型診斷相符，1例意義不明確。

2.2.3 T13高風(fēng)險(xiǎn)病例 338例NIPT結(jié)果異常病例中，T13高風(fēng)險(xiǎn)20例，經(jīng)羊水穿刺確診染色體核型異常6例，占30%，14例正常，3例為13三體綜合征(47,XN,+13)，1例為嵌合體(47.XN.+13[2]/46.XN[98])，1例45,XN,der(13:15)(q10:q10)pat，1例45,XN.der(13;13)(q10;q10)；CMA異常6例，3例為致病性缺失，與染色體核型診斷相符，3例為意義不明確。

2.2.4 性染色體數(shù)目增多病例 338例NIPT結(jié)果異常病例中，性染色體數(shù)目增多84例，經(jīng)羊水穿刺確診染色體核型異常58例，占69.05%，26例正常，其中35例為47,XXY，1例47,XXY[16]/46,XY[84]，5例47,XXX，1例45.X[73]/47.XXX[27]，15例47,XYY，1例46,X.Yqh+，CMA異常63例，其中58例與染色體核型診斷相符，另有1例提示16p13.3-q24.3致病性嵌合重復(fù)90.07Mb，孕婦選擇引產(chǎn)，4例意義不明確。

2.2.5 性染色體數(shù)目減少病例 338例NIPT結(jié)果異常病例中，性染色體數(shù)目減少78例，經(jīng)羊水穿刺確診染色體核型異常22例，性染色體核型異常情況較多，核型結(jié)果有45,X、46,X.i(X)(q10)、47，XXY、45，X與46，XX的嵌合體、45，X與47，XXX的嵌合體、46，XX與47，XXX的嵌合體等，占28.21%，56例正常，CMA結(jié)果異常31例，其中致病性異常16例，意義不明確15例。

2.2.6 其他染色體異常5 5 例 經(jīng)羊水穿刺確診染色體核型異常8 例，占1 4.5 5%，4 7 例正常，分別為4 6.X N.d e l(3)(p12.1,p12.3)、46.XN.der(5)t(3;5)(p24;p13)mat、47，XXY、47.XN.+2[3]/46.XN[97]、46.XN.t(1;13)(q44;q14)[5]/46.XN[95]、47,XN,+20[15]/46,XN[85]、47.XN,+9[55]/46.XN[45]、47.XN.+9[10]/46.XN[90]；CMA結(jié)果異常16例，其中致病性異常4例，意義不明確12例。其中一例NIPT結(jié)果提示15號染色體數(shù)目偏多，超聲提示NT增厚3.6mm，羊水染色體核型為47，XXY，孕婦選擇引產(chǎn)。

2.3 NIPT結(jié)果異常與染色體核型結(jié)果符合情況見表1。

表1 NIPT結(jié)果異常與染色體核型結(jié)果符合情況

3 討 論

1997年Lo[2]等首次在孕婦外周血提取并檢測到來自胎兒并攜帶了胎兒遺傳信息的cffDNA，可以用來檢測胎兒的遺傳性疾病。其后，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，可一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行測序，并重新拼接、組裝，以其高通量、自動(dòng)化分析的技術(shù)優(yōu)勢，促進(jìn)了染色體疾病、遺傳性疾病等的研究[3]，解決了傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查準(zhǔn)確率及敏感度不夠，假陽性率較高等缺點(diǎn)，使NIPT產(chǎn)前檢測技術(shù)逐漸成為新的產(chǎn)前篩查模式。

在本研究中，我們對338例NIPT結(jié)果異常其后選擇介入性產(chǎn)前診斷的病例，結(jié)合胎兒染色體核型結(jié)果及CMA結(jié)果進(jìn)行分析，從數(shù)據(jù)中可以看出，338例病例中共檢出胎兒染色體核型異常177例，占52.37%，CMA異常202例，占59.76%，其中致病性異常166例，占49.11%，其中T21高風(fēng)險(xiǎn)檢出異常68例，占染色體核型異常的38.42%，T18高風(fēng)險(xiǎn)檢出異常15例，占8.47%，T13高風(fēng)險(xiǎn)檢出異常6例，占3.39%，性染色體數(shù)目增多檢出異常58例，占32.77%，性染色體數(shù)目減少檢出異常22例，占12.43%，其他染色體異常8例，占4.52%。在NIPT異常結(jié)果與胎兒染色體核型結(jié)果及CMA結(jié)果的分析中，發(fā)現(xiàn)T21高風(fēng)險(xiǎn)的陽性率87.18%，假陽性率12.82%；T18高風(fēng)險(xiǎn)的陽性率65.22%，假陽性率34.78%；T13高風(fēng)險(xiǎn)的陽性率30%，假陽性率70%；性染色體數(shù)目增多的陽性率69.05%，假陽性率30.95%；性染色體數(shù)目減少的陽性率28.21%，假陽性率71.79%；其他染色體異常的陽性率14.55%，假陽性率85.45%；由數(shù)據(jù)中可以看出，NIPT對T21-三體的檢出率最高，其次是提示性染色體數(shù)目增多的病例，盧建[4]等在對471例NIPT陽性孕婦產(chǎn)前診斷結(jié)果的分析中，得出其研究中NIPT與介入性產(chǎn)前診斷符合率分別為21-三體(92.7%)，18-三體74.7%，13-三體48.9%，性染色體異常48.1%，其他染色體異常8.8%，燕鳳[5]等在對84例NIPT陽性行羊水穿刺驗(yàn)證后的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，NIPT對21-三體的準(zhǔn)確率達(dá)95.8%，18-三體準(zhǔn)確率73%，13-三體準(zhǔn)確率50%，性染色體準(zhǔn)確率71%，本研究與上述研究均提示NIPTT21高風(fēng)險(xiǎn)胎兒染色體異常檢出率最高。文獻(xiàn)提示，妊娠期間異常細(xì)胞可能會(huì)局限于胎盤，出現(xiàn)限制性胎盤嵌合體(CPM)[6]，是引起NIPT結(jié)果與胎兒染色體核型不一致的常見原因，如果異常細(xì)胞存在于胎盤，正常細(xì)胞存在于胎兒組織，可造成NIPT假陽性，如果正常細(xì)胞存在于胎盤，胎兒存在染色體異常，可能出現(xiàn)NIPT假陰性，因?yàn)樘河坞xDNA主要是來源于胎盤細(xì)胞，胎盤嵌合體的存在就有可能導(dǎo)致假陽性情況[7]。宋春林[8]在其研究中發(fā)現(xiàn)1例羊水檢測10%的21三體，分娩后檢測發(fā)現(xiàn)胎盤母體面為21-三體，胎盤胎兒面為46，XN，李發(fā)濤[9]等在其研究中也提示了限制性胎盤嵌合可能導(dǎo)致以胎盤絨毛或胎盤來源物為檢測靶標(biāo)的核型檢測結(jié)果與胎兒實(shí)際核型結(jié)果不一致的可能。在后期臨床工作中，如再遇到T21假陽性病例，應(yīng)及時(shí)與檢測機(jī)構(gòu)溝通，必要時(shí)再次檢驗(yàn)，分析前次檢驗(yàn)出現(xiàn)假陽性的可能，如有條件在產(chǎn)后可對胎盤染色體核型進(jìn)一步檢測，了解是否存在CPM等可能。本研究中T13高風(fēng)險(xiǎn)出現(xiàn)假陽性率較高，達(dá)70%，Chen等的研究[10]發(fā)現(xiàn)，NIPT對18-三體、13-三體檢測穩(wěn)定性較差，假陽性率較高，可能為受GC干擾所導(dǎo)致，他們采用了非重復(fù)掩蓋的人基因組參考序列提高測序短序列的比對匹配數(shù)量，并校正了GC含量的偏倚，使18三體的檢出率從73%提高到91.9%，13-三體的檢出率從36%提高到100%，后續(xù)臨床工作中我們也要不斷從假陽性的病例中不斷改善檢測方法，提高T18和T13的真陽性檢出情況。本研究中對NIPT提示性染色體數(shù)目異常的陽性檢出率與文獻(xiàn)[4]報(bào)道大致相符，但從數(shù)據(jù)中可以看出NIPT結(jié)果提示性染色體數(shù)目增多時(shí)其陽性檢出率(69.05%)高于性染色體數(shù)目減少病例(28.21%)。NIPT提示性染色體數(shù)目異常孕婦，其染色體核型結(jié)果出現(xiàn)較多嵌合體情況，有些嵌合比例較低病例選擇繼續(xù)妊娠，隨訪追蹤孩子情況目前良好。妊娠期間異常細(xì)胞可能會(huì)局限于胎盤出現(xiàn)的局限性胎盤嵌合也可能是NIPT檢測性染色體出現(xiàn)假陽性較高的原因。羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型提示性染色體數(shù)目異常時(shí)，有一部分為胎盤嵌合體，胎兒出生后檢測染色體核型正常[11]，所以，對于羊水結(jié)果提示染色體核型異常的病例，必要時(shí)需檢查孕婦及丈夫外周血染色體情況，新生兒生后必要時(shí)進(jìn)行外周血染色體檢查復(fù)核。

本研究中，338例羊水穿刺病例出現(xiàn)2例流產(chǎn)，穿刺流產(chǎn)率0.59%，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道大致相符。有些孕婦因擔(dān)心羊水穿刺可能出現(xiàn)的流產(chǎn)、感染、胎膜破裂等風(fēng)險(xiǎn)，堅(jiān)決拒絕行介入性產(chǎn)前診斷，根據(jù)本研究的結(jié)果提示，因NIPT提示T18、T13高風(fēng)險(xiǎn)病例，其假陽性率較高，且18-三體綜合癥和13-三體綜合癥多合并胎兒超聲檢查異常，對于堅(jiān)決拒絕羊水穿刺的孕婦，可充分向其交代胎兒染色體異常相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，孕期嚴(yán)密超聲監(jiān)測胎兒結(jié)構(gòu)發(fā)育。對于NIPT提示性染色體數(shù)目異常病例，其假陽性率也達(dá)50.62%(82/162)，性染色體數(shù)目異?？赡軐?dǎo)致第二性征及性器官發(fā)育異常、兩性畸形、閉經(jīng)、不孕不育等[13]，多數(shù)存活至出生的病例無致死性畸形，從本研究數(shù)據(jù)中可以看出NIPT結(jié)果提示性染色體數(shù)目增多時(shí)其陽性檢出率(69.05%)高于性染色體數(shù)目減少病例(28.21%)，提示我們在臨床咨詢過程中向孕婦的解釋可有所輕重指引，減少孕婦的焦慮心情。如孕婦拒絕行介入性產(chǎn)前診斷，可充分告知可能出現(xiàn)的染色體異常結(jié)果及其風(fēng)險(xiǎn)，如孕婦接受異常并要求繼續(xù)妊娠，應(yīng)在孕期嚴(yán)密監(jiān)測，出生后及時(shí)隨訪新生兒情況。上述建議的可行尚需在后續(xù)研究中進(jìn)一步證實(shí)。

在本研究中，CMA異常202例，其中致病性異常166例，意義不明確36例，CMA檢測額外檢出2例致病性異常，1例T21高風(fēng)險(xiǎn)染色體核型46,,XN，CMA提示17p12致病性缺失1.40Mb，1 例提示性染色體數(shù)目增多染色體核型4 6,,X N，C M A 提示16p13.3-q24.3致病性嵌合重復(fù)90.07Mb。染色體微缺失微重復(fù)綜合征是染色體微小片段缺失或重復(fù)，使正常基因發(fā)生改變而導(dǎo)致的染色體病，會(huì)導(dǎo)致先天性畸形、器官功能障礙、生長發(fā)育遲緩、智力障礙等[14]，染色體微陣列分析技術(shù)除了能夠檢出非整倍體異常，還能檢測低水平CNVs，染色體雜合性缺失等染色體異常，較染色體核型分析具有更高的分辨率和敏感度[15]，本研究中的孕婦羊水穿刺時(shí)均同時(shí)選擇染色體核型分析和CMA檢測兩項(xiàng)檢查以提高異常情況檢出率，但盧建[4]等在其研究中僅對NIPT檢查陽性病例中的染色體核型分析結(jié)果正常的81例孕婦進(jìn)行了CMA檢測，并額外檢出4例異常。這種檢查方法在一定程度上節(jié)約了實(shí)驗(yàn)室檢測成本，減輕了孕婦負(fù)擔(dān)，但是對于染色體核型分析正常的孕婦需額外再等待CMA的檢測時(shí)間，如最后因胎兒CMA致病性異常需行引產(chǎn)術(shù)，增加了對孕婦心理及身體的創(chuàng)傷。這也提醒我們在臨床工作中可將兩種檢查方式向孕婦交代，由其選擇，也可適當(dāng)降低檢查成本。綜上所述，NIPT較傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查有較高準(zhǔn)確率及敏感度，假陽性率低，且血清學(xué)篩查無法篩查胎兒性染色體異常，通過NIPT篩查胎兒染色體非整倍體異常及性染色體異常具有較好的臨床價(jià)值。NIPT結(jié)果異常孕婦需進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷排除胎兒染色體異常，如經(jīng)濟(jì)允許可同時(shí)選擇染色體核型分析及CMA檢查，提高異常檢出率。針對無創(chuàng)假陽性病例，應(yīng)做好后續(xù)相關(guān)檢查及研究，進(jìn)一步尋求解決辦法提高NIPT的準(zhǔn)確率和降低假陽性率。