閆馨予 高俊珍

1 內蒙古醫(yī)科大學，內蒙古呼和浩特市 010059； 2 內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科

肺癌是發(fā)病率及死亡率一直居高不下的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署(International Agency for Research on Cancer，IARC)2018年發(fā)布的報告顯示：2018年世界排名前10的癌癥類型中,肺癌不僅是最常見的癌癥(占新發(fā)病例的11.6%)，而且是癌癥里的主要死因(占死亡總病例的18.4%)[1]。肺癌分類中，非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是其最常見的組織學類型，超過60%的肺癌患者在診斷時已為晚期，患者通常無法選擇手術切除治療，只能寄希望于現(xiàn)在主要的治療手段如常規(guī)化療和放射治療[2]。目前常用的醫(yī)學診斷方法主要是低劑量螺旋CT、支氣管鏡檢等技術，雖然低劑量螺旋CT的應用相比胸部X線片明顯提高了非小細胞肺癌早診率，使死亡率下降了20%[3]，但是其非小細胞肺癌的早期診斷率仍然不能令人滿意，腫瘤標志物的識別也是惡性腫瘤診斷的可用方法[4]，但其靈敏度和特異度并不算高。故為了提高5年生存率，迫切需要及時有效的、更早于影像學診斷的、靈敏性和特異性更高的、無創(chuàng)便捷的早期診斷方法。

代謝組學作為一門廣泛應用于多個領域的飛速發(fā)展學科，是基因組學、蛋白質組學的延展。腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中，有特定的代謝過程[5]，或可利用代謝組學技術監(jiān)測這些代謝物的變化或波動情況，識別未知代謝產物達到早期診斷的目的。

1 代謝組學概述

1.1 代謝組學的定義 代謝組學主要通過分析體內小分子代謝產物(相對分子質量<1 000)來推測機體的內環(huán)境是否遭受了病毒入侵或攝入含有毒素的食物藥物并評估機體整體狀態(tài)。目前人們普遍認為代謝組學可用來推測機體受到疾病或外部因素等干擾而產生的最終應答，通過探究生物體受到外部刺激而產生的最終代謝產物的變化。

1.2 代謝組學的特點 圓滿完成人類基因組的測序讓我們在分子醫(yī)學領域進入新紀元。雖然整個生命活動中是基因組提供藍圖，蛋白組提供所需結構并催化激活相應蛋白，但最后生動反映生物體在環(huán)境中的表達仍是通過它的動態(tài)代謝及產物[6-7]。代謝組學具有以下特點：(1)基因和蛋白表達的有效微小變化會逐步放大呈現(xiàn)在最終的代謝物上，許多不能從基因組、蛋白質組體現(xiàn)的變化也可從代謝組中體現(xiàn)。(2)代謝組學位于系統(tǒng)生物學最下游，直接反映機體病理狀態(tài)下所產生的所有代謝產物的最終狀態(tài)，故相較于基因組、轉錄組、蛋白質組更準確[8]。(3)人類基因組大約有4萬，編碼多達100萬個蛋白質[9]，但代謝產物估計只有幾千種，其種類遠少于基因和蛋白的數(shù)目，研究起來相對方便。(4)可選取獲取方式便捷的體液如血液、唾液等作為代謝組學的研究標本。(5)不需要全基因組測序或建立大量表達序列標簽的數(shù)據(jù)庫。這些特點使得代謝組學成為比蛋白質組學更吸睛的研究熱點，但是代謝組學為什么最近才逐漸開始興起呢？之前的分子研究為何始終只圍繞在轉錄組和蛋白質組學方面？部分緣由為代謝組學的技術所限。

1.3 代謝組學的檢測技術 核磁共振(NMR)、液相色譜—質譜法(LC-MS)、氣相色譜—質譜法(GC-MS)、MALDI-TOF-MS等是代謝組學常用技術。NMR是最早的可測量生物標本代謝物的技術，該技術雖然在選取腫瘤標志物[10]、判斷預后[11]、病理分型[11]、早期診斷[12]等方面已成功應用。但它有著不少缺點：光譜分辨率不高；導出的圖譜上受到多種化合物峰值互相干擾的影響以至于解析成果受限，其敏感性也較LC-MS低[13]。LC-MS和GC-MS技術的靈敏度及特異性均高，也被大量應用于各種腫瘤代謝研究中。但它們的局限也讓人無法忽視，GC-MS沒法應用于高極性代謝物，只能在穩(wěn)定的化合物上作用。不能廣泛應用于所有樣本，而且不具備完整的圖譜庫，想要繼續(xù)深入研究，還需要自己建立分析圖庫。所以目前這兩種技術仍處在建立龐大且可供對比的代謝物圖譜階段。隨著代謝組學技術的不斷更新，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術成為了最常用的新型軟電離生物質譜技術之一[14]。

1.3.1 MALDI-TOF-MS技術的原理及特點：它的原理是將合適波長的激光照射在檢測樣品與基質混合形成的共結晶薄膜上，利用基質對激光的強吸收將所測分子鏈逐出并使其離子化，同時基質可使該分子鏈免遭超強激光直接照射而導致的不可逆損傷。最后將生物分子運送至質量分析器中分析具體分子量。MALDI-TOF-MS具有以下特點：(1)方法便捷；(2)樣本簡單預處理即可，低樣本量也能直接研究；(3)快速大范圍檢測的同時還可以保證高靈敏度；(4)更耐鹽、去垢劑和較高濃度緩沖溶液的污染；(5)質荷比值可對應于代謝小分子等的分子量。這些功能使MALDI-TOF MS成為常規(guī)臨床分析的關鍵平臺，非常適合生物活性物質快速、大范圍、高通量的篩選。非小細胞肺癌的早期代謝變化相比于正常細胞很可能只有細微的差別，普通的分析技術也許無法鑒定出這究竟是不是腫瘤細胞，更無法明確這是否屬于非小細胞肺癌，但MALDI-TOF-MS技術極其敏感，即使在接近亞飛克(Sub-femtomole)分子水平的濃度范圍內仍可檢測到生物大分子[15](如多肽、蛋白質)，不僅可以研究細胞內各種基因表達產物的多項代謝過程，而且可以在分子水平上直接分析微量代謝小分子、蛋白質、多肽和它們的一級結構信息(相對誤差僅為0.01%～0.1%)。該技術對于癌癥的診斷具有一定價值[16]，也讓我們對于非小細胞肺癌的早期診斷燃起了希冀。而MALDI-TOF-MS也因其可在細胞層面識別分子與組織病理學特征，更具先進性而成為比其他技術更好的工具，也讓代謝組學在非小細胞肺癌的早期診斷方面更具優(yōu)勢。

1.3.2 MALDI-TOF-MS技術的應用及局限性：現(xiàn)在很多研究者關于組織或組織切片、完整細胞的蛋白全質譜圖分析都直接采用快速便捷的MALDI-TOF質譜技術。一些研究者開始根據(jù)腫瘤細胞在發(fā)展過程中會產生與正常細胞不同的蛋白質和代謝產物這一特性應用于胃癌[17]、肺癌[18-19]、前列腺癌[20]等研究中，并在肺癌的早期診斷和篩查及病理分型中取得了一定的進展。還有報道提出NSCLC血清中存在的4種差異表達蛋白(α1-AG、Tf、TTR、ITIH2)有望成為 NSCLC 新型血清診斷標志物。劉曉晴教授的團隊通過MALDI-TOF-MS技術發(fā)現(xiàn)了NSCLC患者血清及尿液樣本中與健康人不同的多肽，并建立了靈敏度和特異度均高的診斷模型和病理分類模型，更為NSCLC的早期診斷和病理分型診斷提供了強力的補充和憑證。同時還有研究表明質譜成像可以將NSCLC快速而準確的分出亞型。也發(fā)現(xiàn)了可能的耐藥模型和預測分子，為實現(xiàn)肺癌個體化化療提供依據(jù)，助推精準醫(yī)療。這都提示了該技術在非小細胞肺癌的早期診斷方面未來可期，但是由于MALDI-TOF-MS技術是一項新興且具有一定局限性的技術，在研究結果的驗證和解釋缺乏統(tǒng)一的實用性的操作手冊，目前在非小細胞肺癌的早期診斷的研究數(shù)量并不可觀。 目前MALDI-TOF-MS技術已批準用于臨床微生物學以及制藥行業(yè)的常規(guī)使用中，取代了微生物學里傳統(tǒng)的生化測試，但尚未全面進入臨床應用中，尤其是非小細胞肺癌方面的研究，無論是從研究數(shù)量或者是研究結果的可靠性都不能達到100%。該技術目前的局限性有以下幾點：(1)MALDI-TOF-MS技術經常出現(xiàn)所獲蛋白質的峰值表達相近或重疊交錯，增加了潛在腫瘤標志物的分析鑒定難度。(2)MALDI-TOF-MS技術無法確定差異蛋白數(shù)量。(3)樣品的選擇會影響結果的有效性。(4)需要對樣本標準化處理，以確保高度可重復的分析。(5)由于樣品的極端異質性及其動態(tài)蛋白質含量，需對樣品預處理來進行全面分析。(6)該技術本身的分析特性具有相對較低的重現(xiàn)性和分離度。

2 代謝組學在非小細胞肺癌早期診斷的應用

目前代謝組學在腫瘤診斷方面的研究主要還是集中在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等方面，更具說服力的就是Odunsi團隊因當前可用的血清生物標記物不足以可靠地區(qū)分上皮性卵巢癌(EOC)患者和健康個體。該團隊利用1H-NMR光譜分析從38例EOC患者、12例卵巢良性腫瘤患者(術前血清)及53例健康女性的血清樣本進行了分析研究，發(fā)現(xiàn)能100%識別正常絕經前婦女、卵巢良性腫瘤和卵巢上皮性癌，對絕經后婦女和卵巢癌的識別率也高達97.4%和97%。然而即使在研究較多的婦科腫瘤方面，也離真正建立完整的診斷模型以及實現(xiàn)診斷系統(tǒng)化有著不小的距離。雖然研究者們已經獲得了大量能反映機體病理變化的生物代謝物，但是這些潛在的腫瘤標志物之間并沒有很強的關聯(lián)性，而且缺乏交叉驗證，雖然血液、尿液、唾液等發(fā)現(xiàn)了越來越多的潛在生物標志物，但目前仍處于基礎研究中。在NSCLC細胞中持續(xù)特異高表達的生物標志物(癌胚抗原等)在臨床實踐中成為常規(guī)檢測項目，但這些標志物雖能輔助診斷非小細胞肺癌，但陽性率和敏感度較弱。故而特別期望能多角度尋找特異性、靈敏度均高的NSCLC早期診斷標志物。

NSCLC的早期診斷及病理分型最開始還是從蛋白質組學方向出發(fā)研究。楊洋等研究者應用SELDI-TOF-MS結合SVM對NSCLC患者和對照組(兩組分別為112、123)進行血清蛋白質質譜的研究分析，篩選出3個差異性顯著的蛋白標記物(載脂蛋白C-Ⅰ觸珠蛋白α1鏈和S100A4蛋白)，發(fā)現(xiàn)了這3種差異蛋白的協(xié)同應用有利于NSCLC的早期檢測和診斷。隨后有研究報道指出碳酸酐酶1可成為非小細胞肺癌的早期診斷血清標志物。他們采用二維凝膠電泳(2DE)聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術分別提取了肺癌組、良性對照組、健康組(三組分別為11、12和10)的血清蛋白,得到12種差異表達的蛋白質，并利用ELISA和蛋白質印跡在擴大樣本量中(三組分別為22、18和18)驗證了所得蛋白，其中碳酸酐酶1(CA1)的表達在肺癌組明顯升高。Klupczynska團隊利用ZipTip技術聯(lián)合MALDI-TOF-MS對癌癥患者(n=153)和對照組(n=63)的血清樣本分析研究發(fā)現(xiàn)C3和纖維蛋白原α鏈的片段具有顯著差異，該組研究不僅找到了蛋白標志物，而且進行了驗證，步驟更加嚴謹。有學者在300例肺部良性病變患者和NSCLC患者之間觀察到疾病特異性觸珠蛋白-β，該蛋白的糖基化可以將NSCLC與BLD區(qū)別開來。還有研究團隊甚至通過MALDI-TOF MS對50例參加厄洛替尼和索拉非尼Ⅱ期試驗的NCSLC患者進行了血清肽譜分析。在所有出現(xiàn)嚴重毒性反應的患者的血清中檢測到兩種特異性肽，為助推精準醫(yī)療提供了新思路，但是樣本量偏小，代表性不高。后續(xù)隨著研究技術的不斷更新，大家開始將目光放在了能夠更好地反映細胞究竟發(fā)生了什么的代謝組學上。Zhang的研究團隊想評估腫瘤發(fā)展過程中的血清代謝物變化，選取了25例Ⅰ期肺癌患者和相匹配的健康對照組，用1H-NMR聯(lián)合RRLC確定了25個能高靈敏度區(qū)分兩組的代謝產物，提示了早期肺癌確實可用代謝組學來分析探究。還有研究團隊采用高靈敏度、高分辨率的UPLC-Q-TOF檢測健康人(對照組)和肺癌患者(病例組)尿液中微量分子代謝物，成功發(fā)現(xiàn)11個常見的代謝標志物可以用來描述肺癌的病譜特征，其中4例具有診斷肺癌的潛力[曲線下面積(AUC)>0.8]。隨著技術不斷發(fā)展，Miyamots利用GC-MS分析研究了NSCLC和其他肺癌患者的血清樣本，賴氨酸、色氨酸和組氨酸的濃度在NSCLC明顯降低，而乙醇胺、甘油、麥芽糖、乳酸、谷氨酸和棕櫚酸的濃度中明顯升高。這些代物都有顯著差異，有可能具有NSCLC的早期診斷意義。而Leonor等使用1H-NMR對非小細胞肺癌患者在疾病不同階段的血清代謝譜研究，發(fā)現(xiàn)與對照組相比非小細胞肺癌的代謝譜里有18種代謝物的濃度具有統(tǒng)計學意義的變化。這無疑為尋找非小細胞肺癌的早期診斷生物標志物提供了強力的補充證據(jù)；同時還發(fā)現(xiàn)有17種可反映NSCLC患者不同疾病發(fā)展階段的代謝物，為NSCLC患者的早期發(fā)現(xiàn)、與健康個體的鑒別以及了解疾病各階段的病理生理機制提供助力，單單通過傳統(tǒng)的血液指標可無法做到區(qū)分NSCLC的發(fā)展階段。Mu等使用偽靶向GC-MS研究了136例非吸煙女性受試者(65例NSCLC患者，6例良性肺腫瘤患者和65例健康對照)的代謝譜，發(fā)現(xiàn)代謝譜出現(xiàn)了能量代謝、氨基酸代謝和脂質代謝紊亂，氧化應激等變化。該研究為NSCLC的診斷提供了半胱氨酸、絲氨酸和1-單油酰甘油作為生物標記物。還有研究團隊利用代謝組學技術對156例Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者和60例健康對照者的血漿樣本研究發(fā)現(xiàn)β-羥基丁酸，檸檬酸和富馬酸顯著不同。Ruiying研究團隊對142例NSCLC患者和159例對照組患者進行了非靶向代謝組學分析并發(fā)現(xiàn)了6種代謝物可作為潛在生物標志物用于NSCLC。該結果也通過TCGA數(shù)據(jù)庫中的1 027例NSCLC患者和108個癌旁組織的轉錄組學分析得到了進一步驗證。還有研究提示含膽堿的磷脂可能是早期NSCLC的標志物。磷脂組的進一步研究對于更好地描述肺癌患者體內代謝物組成的變化至關重要。有研究證明使用UPLC-MS分析 99例NSCLC患者和112例對照者的血漿樣本發(fā)現(xiàn)皮質醇，可的松可作為早期診斷標志物，且同時具備高敏感性和特異性，還觀察到特定血漿代謝物與NSCLC的病理類型或分期之間存在顯著關聯(lián)。這都表明代謝組學確實擁有無限潛力。

當然，非小細胞肺癌等方面的研究也在逐步開展，但由于之前所提的諸多限制如技術分析問題以及現(xiàn)在的研究數(shù)量情況、驗證方式的選擇和實驗結果的準確性，代謝組學在非小細胞肺癌的早期診斷研究仍無法進入臨床應用中。雖然說正向著臨床實用性方向發(fā)展，但還只是在初始階段，仍需要不斷拓展代謝組學在非小細胞肺癌應用方面的廣度和深度。

3 展望

非小細胞肺癌的早期診斷目前仍是研究者們聚焦的方面，目前多組研究顯示非小細胞肺癌患者與健康人群的血清多肽存在差異，我們希望采用MALDI-TOF-MS技術結合代謝組學數(shù)據(jù)處理手段，建立一種新的NSCLC早期診斷模式，從血清學角度發(fā)現(xiàn)早期非小細胞肺癌潛在生物標志物，而MALDI-TOF-MS測定和鑒定不同類型和階段肺癌生物分子的能力已被肯定。但該技術所需費用高，且仍需要大量數(shù)據(jù)來支持研究結果，包括研究質量也需要提升，如果能夠增進可靠的交叉驗證方法就能更進一步擴展研究平臺。相信隨著MALDI-TOF-MS技術不斷應用于非小細胞肺癌，會更加深刻、全面認識發(fā)生機制、代謝網絡改變等方面，在早期診斷方面也一定會獲得長足進步。