高楊 李婭 秦昆明 楊超 孫戡平 劉晴, 鄭琳玉, 蔡寶昌, 金俊杰**

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210014；2.南京中醫(yī)藥大學附屬南京海昌中藥集團有限公司，江蘇 南京 210061；3.南京海源中藥飲片有限公司，江蘇 南京 210061；4.南京中醫(yī)藥大學 國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京 210023)

洋金花Daturaeflos為茄科植物白花曼陀羅DaturametelL.的干燥花，性味，辛溫；有毒[1]。洋金花為《中國藥典》2020年版一部收藏品種，只包含生品洋金花。洋金花炮制品制洋金花，只有《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》[2]收載：將生洋金花用生姜汁拌勻，待吸透，略潤，切成1～2 mm細絲，置鍋內(nèi)，炒干，趁熱噴灑白酒，拌勻，稍悶，晾干(每生洋金花100 kg，用生姜25 kg打汁，60°白酒12.5 kg)。項目組已對制洋金花的炮制工藝進行優(yōu)化研究[3]，得出以東莨菪堿含量和水分含量的綜合評分為指標，采用正交試驗考察生姜打汁后加水量、悶潤時間、炒制溫度、炒制時間4項指標，確定制洋金花的最佳炮制工藝，篩選出制洋金花的最佳工藝參數(shù)為生姜打汁后加水量3倍，悶潤時間40 min，炒制溫度270～300 ℃、炒制時間5 min，炮制后的洋金花有酒香氣和微姜味。臨床上內(nèi)服中毒報道多由誤服或用量過度所導致，臨床上報道洋金花急性中毒6例[4]。目前未見洋金花炮制品制洋金花急性毒性和亞慢性毒性實驗研究報道，對制洋金花的毒性實驗研究可以擴大制洋金花的用藥范圍，提高制洋金花的用藥安全性，更好地將制洋金花運用于臨床以及提供更好的用藥合理性，本研究對洋金花生品和炮制品進行急性毒性和亞慢性毒性實驗研究。

1 儀器與材料

1.1儀器 JJ600A型電子天平[美國雙杰兄弟(集團)有限公司];JYZ-D57榨汁機(九陽股份有限公司)。

1.2藥材 洋金花(產(chǎn)地安徽)和生姜(產(chǎn)地山東)，購自南京海源中藥飲片公司(以下簡稱海源)。洋金花10批(產(chǎn)地分別為內(nèi)蒙、安徽、吉林、河北、廣西、山東、山西、河南、廣東、江西)，購自安國市聚福中藥材有限公司(以下簡稱聚福)。洋金花經(jīng)南京海源中藥飲片有限公司首席質(zhì)量官執(zhí)業(yè)中藥師丁斐鑒定，為茄科植物白花曼陀羅DaturametelL.的干燥花。

1.3實驗動物 ICR小鼠92只，雌雄各半，體重18～22 g，SPF級，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2017-0001，動物質(zhì)量合格證號：201912724。

2 方法

2.1制洋金花樣品制備[3]取50 g洋金花樣品(海源1批，聚福10批)，用生姜12.5 g打汁后加3倍水，25 ℃下悶潤40 min后切碎，在270～300 ℃下炒制5 min，29～30 ℃下噴灑6.25 g的60°白酒后，25 ℃下悶30 min，晾干。

2.2洋金花水提取物制備 洋金花樣品(海源1批次)，剪碎，用8倍體積的純化水于圓底燒瓶內(nèi)浸泡0.5 h，電熱套加熱，回流提取，藥液沸騰后調(diào)整溫度至藥液微沸，繼續(xù)煮1 h后，濾過藥液，重復2次，將濾液合并濃縮，得到洋金花水提取物，生藥含量濃度1 g·mL-1。

2.3制洋金花水提取物制備 以制洋金花樣品(海源1批，聚福10批)，剪碎，用8倍體積的純化水于圓底燒瓶內(nèi)浸泡0.5 h，電熱套加熱，回流提取，藥液沸騰后調(diào)整溫度至藥液微沸，繼續(xù)煮1 h后，濾過藥液，重復2次，將濾液合并濃縮，得到洋金花水提取物，生藥含量濃度1 g·mL-1。

2.4最大給藥量急性毒性預實驗 選取ICR小鼠4只，雌雄各半，體重為18～22 g，分籠飼養(yǎng)。實驗前小鼠禁食24 h，以制洋金花(海源1批次)水提取物生藥含量濃度1 g·mL-1，10 g小鼠體重最大灌胃給藥體積0.4 mL，一次性灌胃給藥，給藥后給飼料，自由飲水，觀察24 h，記錄小鼠死亡情況，脫頸椎處死后，解剖觀察臟器。給藥后，小鼠飲食和活動正常，毛色正常，無死亡情況，解剖觀察心、肺、胸腺、肝、脾、腎均正常，切開小鼠胃后，肉眼觀察有飼料，未有制洋金花水提取物，給藥前后的小鼠體重未出現(xiàn)大幅下降。

2.5最大耐受量急性毒性預實驗 選取ICR小鼠8只，雌雄各半，體重為18～22 g，分籠飼養(yǎng)。實驗前小鼠禁食24 h，以制洋金花(海源1批次)水提取物生藥含量濃度1 g·mL-1，10 g小鼠體重灌胃給藥體積0.4 mL，1 d內(nèi)2次和3次灌胃給藥，末次給藥后給予小鼠飼料，自由飲水，觀察24 h，均無小鼠死亡情況，各臟器正常，肉眼觀察胃部有飼料，未有制洋金花水提取物。

由預實驗結(jié)果可得，以1 d內(nèi)給藥3次的最大耐受量急性毒性預實驗結(jié)果為依據(jù)開展最大耐受量急性毒性正式實驗；以最大給藥量急性毒性預實驗結(jié)果為依據(jù)開展亞慢性期毒性正式實驗。

2.6最大耐受量急性毒性正式實驗 選取ICR小鼠56只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，空白組8只，制洋金花(海源1批，聚福10批)水提物組各4只，洋金花(海源1批次)水提取物組4只。除空白組小鼠外，實驗前小鼠禁食24 h，制洋金花(海源1批，聚福10批)水提取物給藥組小鼠，以制洋金花(海源1批，聚福10批)水提取物生藥含量濃度1 g·mL-1，10 g小鼠體重灌胃給藥體積0.4 mL，1 d內(nèi)3次灌胃給藥，洋金花(海源1批次)水提取物組小鼠，以洋金花(海源1批次)水提取物生藥含量濃度1 g·mL-1，10 g小鼠體重灌胃給藥體積0.4 mL，1 d內(nèi)3次灌胃給藥，末次給藥后給予飼料，小鼠自由飲水，觀察7 d，記錄小鼠體重和死亡情況，第7 d后，脫頸椎處死小鼠后，解剖觀察小鼠臟器。

2.7亞慢性毒性正式實驗 選取ICR小鼠24只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，空白組8只，制洋金花(海源1批次)水提物組16只。除空白組小鼠外，實驗前小鼠禁食24 h，制洋金花(海源1批次)水提取物給藥組小鼠，以制洋金花(海源1批次)水提取物生藥含量濃度1 g·mL-1，10 g小鼠體重灌胃給藥體積0.4 mL，每天灌胃前禁食3 h，灌胃給藥1次，給藥后給予飼料，小鼠自由飲水，連續(xù)給藥7 d，記錄小鼠體重和死亡情況，末次給藥24 h后，脫頸椎處死小鼠后，解剖觀察小鼠臟器，稱脾、腎重，記錄臟器系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1最大耐受量急性毒性正式實驗結(jié)果 實驗觀察期間，各組小鼠飲食和活動正常，毛色光澤，生長良好，未見中毒表現(xiàn)，無死亡情況，7 d后處死小鼠，肉眼觀察小鼠心、肺、胸腺、肝、脾、腎均正常，各器官均無異常，給藥組各組小鼠體重呈上升趨勢，組間無顯著性差異。因此，以人60 kg體重及制洋金花臨床最大用藥量1.5 g，小鼠MTD>120 g·kg-1，相當于60 kg體重人用藥量的4800倍，屬無毒類。最大耐受量急性毒性正式實驗結(jié)果見表1。

表1 最大耐受量急性毒性正式實驗結(jié)果

3.2亞慢性毒性正式實驗結(jié)果 實驗觀察期間，各組小鼠飲食和活動正常，毛色光澤，生長良好，未見任何中毒表現(xiàn)，無死亡，7 d后處死小鼠，肉眼觀察小鼠心、肺、胸腺、肝、脾、腎均正常，各器官均無異常，給藥組各組小鼠體重呈上升趨勢，組間無顯著性差異，脾臟和腎臟系數(shù)組間無顯著性差異。因此，制洋金花以小鼠每日給藥劑量以體表面積換算人(20 g小鼠體表面積為1，60 kg體重人體表面積等效量為346)每日給藥劑量為276.8 g，顯著大于臨床用量1.5 g，是臨床用量的184倍，臨床7 d內(nèi)使用制洋金花可以加大劑量使用。亞慢性毒性實驗結(jié)果見表2。

表2 亞慢性毒性正式實驗結(jié)果

4 討論

對于毒性中藥，既要在工藝優(yōu)化，也要提高臨床用藥劑量安全性，達到減毒增效的目的[5-7]。在中藥炮制減毒增效方面研究，從醋制減毒入肝、增效角度就來研究醋制中藥[8]；汗?jié)n法炮制了哥王藥材中芫花素的含量有所降低，抗氧化活性增強，具有減毒增效效果[9]；去油制霜可影響美洲大蠊脂溶性成分含有量及小分子多肽Papp，可能是其減毒增效的機制[10]；黃精經(jīng)過炮制后成分有顯著變化，九蒸九制的黃精具有減毒增效的作用[11]。開展毒性藥材動物實驗必不可少，以急性毒性和亞慢性毒性試驗聯(lián)合開展，結(jié)果顯示：按臨床劑量使用地黃提取物是安全無毒的，夏枯草浸膏屬于無毒級物質(zhì)，翅果仁屬于實際無毒物質(zhì)，槐定堿具有一定毒性，但停止染毒30 d后肝、腎等實質(zhì)器官損傷可得到恢復[12-16]。

通過最大耐受量和最大給藥量急性毒性預實驗分別進行研究，有助于急性毒性和亞慢性毒性正式實驗合理設計，以1 d內(nèi)給藥3次的最大耐受量急性毒性預實驗結(jié)果為依據(jù)開展最大耐受量急性毒性正式實驗；以最大給藥量急性毒性預實驗結(jié)果為依據(jù)開展亞慢性期毒性正式實驗。

最大耐受量急性毒性試驗結(jié)果得出，洋金花生品和炮制品急性毒性試驗小鼠MTD大于120 g·kg-1，最大耐受倍數(shù)為4800倍，屬于無毒。給予洋金花和制洋金花后，小鼠均無毒性反應，組間體重無顯著性差異，表明洋金花炮制前后毒性反應無差異。亞慢性毒性試驗結(jié)果得出，制洋金花以小鼠每日給藥劑量以體表面積換算人(20 g小鼠體表面積為1，60 kg體重人體表面積等效量為346)每日給藥劑量為276.8 g，顯著大于臨床用量1.5 g，是臨床用量的184倍，臨床7 d內(nèi)使用制洋金花可以加大劑量使用。

洋金花作為一種毒性藥材，在毒性實驗研究方面較少報道：洋金花對鯉、鳊和白鰱具有劑量致死性，白鰱致死劑量最低[17]；對家兔和豚鼠皮膚毒性試驗表明無刺激性和致敏性[18]；洋金花靜脈滴注大鼠，可以短暫興奮，隨即減弱，3 d恢復正常[19]；曼陀羅種子對小鼠的灌胃致死中量分別為19.05 g·kg-1和23.53 g·kg-1體重[20]。以上文獻報道和本實驗取得的研究結(jié)果分析洋金花對各種實驗動物產(chǎn)生毒性反應、藥材不同給藥方式毒性反應和藥材不同用藥部位產(chǎn)生毒性反應進行比對，表明洋金花對魚類毒性反應較大；藥材不同給藥方式毒性反應：靜脈滴注>口服>經(jīng)皮給藥；藥材不同用藥部位毒性反應：種子的毒性大于花的毒性。本次實驗中炮制前后的洋金花，急性毒性無差異，推測其毒性在動物整體毒性反應上表現(xiàn)不明顯，可能在臟器長期蓄積有關(guān)，或者由于洋金花含有東莨菪堿成分和其用于外科麻醉的作用，多作用于中樞神經(jīng)，下一步將繼續(xù)開展制洋金花的毒性研究，同時查找出制洋金花中的毒性成分開展研究，特別是對中樞神經(jīng)藥效毒性作用。